Casa abieiia al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA


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1 Casa abieiia al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA JDIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL A QUIEN CORRESPONDA: Por medio de la presente se hace constar que el (la): J,4-5zmK i M. EN C.HECTOR FERNANDO SERRANO del Departamento de: CIENCIAS DE LA SALUD de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social: J TITULO. Análisis molecular del efecto antagónico de una ceoa avirulenta de Erwinia fracheiphila sobre Xanfhomonas campestris pv. phaseoli y Pseudomonas syringae p.v. phaseolicola, causantentes del tizón común y tizón de halo del frijol (Phaseolus vu/garís) 1 ALUMNO: Mejía Sánchez Dimas u/ LICENCIATURA Biología Experimental J PERIODO: Mayo 18, 1995-Noviembre 18, 1995,/ Se extiende la presente para los fines que ai interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a los nueve días del mes de Mayo de mil novecientos noventa y seis. Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo" UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purisima lztapalapa México, D.F. A.P Fax: (5) Tels ~81 Y ir'

2 - - c UNIVERSiDAD AUTONOMA METROPOLITANA Umdad Iztapalápa Di~isión de Ciencias Biológicas y de la Salud Analisis Molecular del Efecto Antagónico de una Cepa Avirulenta de Erwinia tracheiphila sobre Xanthomonas campestris p.v. Phaseoli y Pseudomonas mringng- p.v. Phaseolicola, Causantes del Tizón Común y Tizón de Halo del Frijol (Phaseolus ~1eans.y REPORTE FINAL DE SERVICIO SOCIAL. Dimas Mejía Sánchez Licenciatura en Biología Experimental México, D.F., 14 de Diciembre de 1995

3 . ~f,\nr\lisis MOLECULAR DEL EFECTO ANTAGÓNICO DE UNA CEPA \VIRULENTA DE Envulia &acheiphiia sobre LYanLhomonm caqestrii. pv. :&woii Y Psewdomonas syringae pv. phaseoticoia, CAUSANTES DEL TIZCIN ('OXlfiN Y 'I'IZÓN DE HALO DEL FRIJOL (Phaseoim VZC~~W T)~~ Jiistificación. t:i control qiiimicii tlzl tizhii comíia y 21 tizsn de halo dcl frijol (i'humi vj,i.yir us Lj causado por Xunthomonas campestris pv. phaseoh y Pseudomotas zvi.iil,qciií pv. phuseoiicoia. respectivamente, promueve la selección de cepas b:icterianas resistentes, ocasiona daños a la microflora nativa y o,ener:i i.i)iittiininiición. entre otras cosas. tina tie las alternativas para evitar este tipo Cls prt~hieiiitis+ 2s e1 control biológico en la modalidad de antagonismo; sin embargo, se ii:.crsita investigación básica que nos permita conocer la naturaleza de este ;iiit;igonisino. conocer tie que tipo ts pc,rsptctiv;is a la obtención de iiii;iiiki iictividiitl sin quc se iiltcrc la calidad del producto. v la molécula inhibitoria y su origen, con plantas transgénicas csistzntes que cuentm cori I:i ii.it~~rill~m ik la presnte investigación incluye aspectos básicos y qlicdos.

4 INTRODUCCION El frijol (fhaseolils vulgaris Lj, formó y forma parte importante en la dieta del hombre, en particular en la cultura Mexicana, actualmente este cultivo representa una :ilternativa nutricional para una población creciente, por su alto contenido de proteínas, tambih se perfila como el alimento complementario del maíz por su alto contenido de lisina. ya que esta graminea es deficiente en este aminoácido (Engleman 1979). Sin embargo, así como otros monocultivos, el frijol es afectado en cuanto a su calidad y rendimiento debido a diversos factores ambientales, plagas y ataque de patógenos, cntre los que destacan las bacterias, dentro de estos patógenos se encuentran dos que rrtlricen notablemente la calidad y cantidad del producto, el tizón comíin (iicitithomontrs campestris p.v. phaseoli) y tizón del halo (Pseudomonas syringae p.v. phnseolicoin). el ataque de estos agentes es similar, ya que se presentan en cualquier ctapa del desarrollo del cultivo, lesionando hojas, tallos, vainas y semillas, llegando a penetrar incluso al sistema vascular (Agrios 1957) Campos (19S7) r6porta que,y.c pv. phaseoli puede llegar a ocasionar una perdida del 30% del producto. por ejemplo Para t-ed~cif el efecto de estas enfermedades, se cuentan con diversas ;1]ternativ;ls como son; la obtención de semilla libre del patógeno, la rotación de coltivos y el uso dt compuestos químicos como los antibióticos y los compuestos derivados del cobre (Sigze iyy3); sin embargo, existen diversas experiencias que demuestran que estos fitopatógenos desarrollan fácilmente la resistencia hacia estos productos debido en parte a su acelerada velocidad de reproducción y a la presencia de material txtracromosómico (plasmidos) que cuenta con la capacidad de conjugarse y autoreplicarse (Ritchie et al 1991, Sigee 1993, Bender et al 1986, Burr et al 1988). Por ejemplo, para controlar la infección del tomate causada por Pseiimonar sdyrj,lgl2e p ~ pap&pu. se estableció un programa de control para 1982 mediante el

5 ~ - 3 i I! i j I 1 i Í I i I,150 de fstreptomicina; sin embargo, para 1985 cuando se realizaron diversos muestreos se encontró que dicho patógeno ya presentaba resistencia hacia este producto y sz determinó que dicha resistencia estaba mediada por el piasmido 68 ).!Da y esto representó un gran problema económico para estos productores en USA, drbido a que no se tenia ninguna otra alternativa para el combate de dicha bacteria (Sigee 1993). En años recientes también se ha reportado a diversos patovares de Fsrdnmonas syringae que han adquirido resistencia a productos a base de cobre ( Sigee 1993, Bender 1986). Tomando en cuenta estos antecedentes y que dichos [JrOductOS químicos también afectan organismos benéficos, además de que por sí solos representan un peligro para el consumo humano de productos vegetal es,^ para el iquilibrio del medio ambiente en general (Tagg et al 1971, Sigee 1993), es necesario iinplrmentar medidas alternativas yio complementarias que ayuden a reducir el efecto (It. estos patógenos, pero a su vez que estas medidas sean más suaves con el ambiente. E r i este contexto una de las alternativas viables es el control biológico, en su riiotlalidad de antagonismo, debido a su especificidad y origen ( Sigee 1993, Ellis et al IY79, Iseiibeck et al 1985, Kerr et al 1973, Vanneste et al 1992, Fravel 1988, Tagg et al 1971:i, por ejemplo Lalia y colaboradores (1992) reportaron el uso de Pseudomoizas,f!o!irescentes para el control de Rhizoctonia salani causante de la pudrición de la raíz del melbn; también Liao (1989), ha demostrado que Pseudomonas putida inhibe el crecimiento de Erwinia carotovora sup. sp carotovora, así mismo se han obtenido resultados favorables con el control de Agrobacteriurn turnefaciens empleando organismos antagónicos como Agrobacteriurn radiobacter (Kerr et al 1973, Ellis et nl 1979, Sigee 1993). Sin embargo, para poder utilizar todo el potencial que ofrece est2 mccaniismo mtngónico es importante establecer investigaciones a nivel bioliigico, celular y molecular para conocer el mecanismo mediante el cual opera este control biológico.

6 . 4 Las aportaciones de diversos autores nos indican que esta actividad antagónica de ;ilgunos microorganismos se puede deber a la competencia por espacio y nutrientes, por predación y por antibiosis (Sigee 1993, Ellis et al 1979, Vanneste et al 1992, Fravel IYSS). Este hltimo termino implica la síntesis de diversos metsbolitos de orden wcuiidario por parte del organismo antagónico, los cuales pueden ser; Sideroforos, que son grupos quelantes, principalmente de hierro y se manifiestan cuando el organismo se desenvuelve en ambientes deficientes en este mineral, activándose el sistema genético (plasmidos) responsable de su producción y se sintetizan estos productos, los cuales forman un complejo ferrisideroforo, secuestrando el fierro de su medio ambiente lo que les permite tener ventajas sobre los organismos no productores <!e :;ideroforos, disminuyendo las poblaciones de estos últimos entre los que se mcuentran muchos fitopatógenos del suelo (Sigee 1993, Liao 1989). Antibióticos.?Stas sustancias tienen un bajo peso molecular y un amplio espectro de acción, son resistentes a protensas y la información para su síntesis puede radicar en plasmidios; sin embargo, también pueden tener su origen en un simple rompimiento de moliiculas externas (azucares, arbutina) y una característica que los distingue es su sensibilidad a IR temperatura. Entre los mecanismos de acción conocidos de este tipo de compuestos es la inhibición de la función enzimáticaya que actúan como análogos del sustrato y en otros casos se unen al ADN, bloqueando la función de molde del organismo sensible (Sigee 1993, Vanneste et al 1992, Ishimaru et al 1988, Ballester et al 1'977j. Ilscterioanas, a este tipo de moléculas se les define como de naturaleza proteica clisica, su espectro de acción se limita a organismos muy relacionados, son sensibles il proteasas y pueden ser inducidos por luz UV o mitomicina C. En los organismos conocidos como productores de este tipo de sustancias, se ha encontrado que la información genética para su elaboración radica en plasmidos y el mecanismo de acción discutido por Vidaver (1983), es que al parecer se requiere de receptores de,,,einbrana específicos primero para que ocurra la Unión 8 1s célula del Organismo

7 * J.;snsible, después la posible entrada a la célula y la muerte de estos organismos puede ocurrir por diversos mecanismos como son: alterando la síntesis de proteínas y ácidos ~iticleicos como el ADN, desestabilizando el flujo de energía y/o modificando la iiitegridad de In membrana celular (Tagg et al 1971, Mair et al 1972, Gonzáles et al 1987). Aigu~itts de astas sustancias (antibióticos, bacteriocinas y sideroforos) se han podido aislar y caracterizar (como la Herbicoiina I, producida por Erwinia herbicnlu) cloiiar ( como lo reporta Sigee (1992) para agrocin 84, producido por Agrohacterium rndinhncfer y ferrorosaniiua A, producida por Erwinia rhapontici) e inclusive se les 11% tmtado de mejorar por ingeniería genética (agrocin 84) (Sigee 1992) para iiicrzmeritar el espectro de acción y los organismos a los cuales afecta, esto es posible graciiis a las técnicas de biología molecular que nos permiten aislar, caracterizar J' iiiiiilificar geiies de cualquier origen, insertarlos en otras bacterias e incluso en plantas para qut: puedan sintetizar "su" propio antibiótico en caso del ataque de fitopatógenos (Dmmto 1490, S ip 1943). Por totlo lo expuesto anteriorniente y aprovechando que en el laboratorio d: fitobxteriolo~ía de la Universidad Autónoma Chapingo se ha aislado una cqiti.. antagónica avirulenta (CAE-01) a X. c. pv. phaseoli y a P. S. pv. yiusru~x~~i~, causantes del tizón común y tizón del halo del frijol respectivamente (Rodríguez et al 1994:). en el presente trabajo se pretende determinar la sustancia responsnbk: drsl mtagonismo de la cepa CAE-O1 sobre las bacterias patógenas del frijol y de ser posibis d~trniiiiiw la secuenciagenétics bacteriana responsable de tal antagonismo.

8 j c XI.- OBJETIVO 1 j x C'oiiocrr si el iiiitagonisiiio de la cepa CAE-O1 de Erw!,v.ia truchephilq sobre,'i.kunihci.mnizas cmpestris pv. phaseoh y Pseihciornonas syri?igae pv. phaseolicola es ivodiicto de Itl síntesis de proteínas, antibióticos, o de cualquier otro tipo de sustancia

9 . 7 I REVISION DE LITERATURA. FSI frijol (phaseolus vulgaris L.) pertenece al género phaseolüs, a la famiha l~,pmiwsm, siibfamilia Pnpilionoideae, tribu Phasedeue y sobtribo Ph,asmlinue. origen. No se ha determinado con exactitud el origen de esta leguminosa, sin embargo $[iranda (1967) y Gentry (1969) citados por Engleman (1979) sitúan al progenitor de p. wlgaris en Ins vertientes occidentales de México y Centro América, específicamente ~"2;:xico-Guateinnla. tomando en cuenta In diversidad genética y que las formas silvestres de P.vrdgaris se localizan en las partes occidentales y sur de México, en ~1.~kenifi1t-1 y en ilondurna. I?ylPC~)R'TANCIA DEL CULTIVO DEL FRIJOL. Ll frijol es zi segundo producto de mayor consumo humano, sobretodo para la población de bajos recursos, Bressani (1965) citado por Pantzay et. al (1983) menciona que cl frijol (Phaseolus vdguris L.) proporciona el 33% de la proteína diaria consumida por la población rural y urbana de Latinoamérica, aportando arninoicidos cvncialzs que son deficientes en el maíz, por ejemplo la lisina (Engleman 1979) y los dciiiis cultivos amiliceos. Es importante indicar que el contenido de proteínas del fkijol oscila entre 19.2 a27.9% (Pantmy 1983). 'I'TZON DE HALO DEL FRIJOL. Esta enfermedad esta causada por Pseudomonas syringae pv. phuseolicoio, i:i cual ataca principalmente las hojas, sin embargo también puede afectar al sistema vascular. Su incidencia involucra manchas cafés irregulares en el envés de la hoj:i, rodeadas por un halo amarillo-verdoso, dando una apariencia traslúcida y húmeda. (Streeta 1979).

10 ~ ~ Y-. 'ri%on COMUN DEL FRIJOL. El agente causal de este tipo de desorden es Xunthomonas campestris pv. pitrseolr. y los síntomas son similares al tizón de halo, su principal diferencia visual sntre estas dos enfermedades, es que el tizón común, no presenta el halo amarillo- vrrdoao. E1 tizón común se cmcteriia por las pequenas manchas en el envés de las hojas, irregulares, cafés, angulares, traslúcidas, húmedas, rodeadas por un borde am arillo, estas manchas pueden unirse e invadir la hoja (Streets 1979). CUANTIFICACION DE PKOTEINAS POR EL METODO DEL ACIDO I31CiNCONINICO. Este inhodo nproveccha la reducción en condiciones alcalinac del Cu (11) a Cu (1) por zfccto de la presencia de proteínas de una forma dependiente de la concentración. 1:I ácido hicinconinico es II~I reactivo croriiogenico altamente específico para el Cu (I), formando un complejo púrpura con absorbancia máxima a 564 nm, Esta absorbmicia rs dirrctmente proporcional a la concentración de proteínas (Smith 1985). i ~ ELECTKOFORESIS 1 i I!! (SDSPAGE). Debido a que los polipéptidos cuentan tanto con cargas negativas, como positivas; uu grupo amino (positivo) en un extremo de lacadenay un grupo carboxilo (negativo) en otro extremo, además de diferentes cargas en los extremos laterales, esto úitimo <It:pt.iidirndo de la composición de aminoácidos del polipéptido. Estos polipéptidos se comportan como anfoteros; se titulan como ácidos y como bases, además de qiit: prrsentan puntos isoeléctricos en los cuales suelen ser menos solubles, dadas estas características las proteínas pueden ser separadas por electroforésis, esto es por 1:i migración diferencial en un campo eléctrico.

11 T I c '2 I,' lil porcentaje de misración de las proteínas a través del campo elkctrico depende,ir ;ilo,iinos parámetros como son: la carga neta, el tamaño de la proteína, la fuerza ioiiica, la viscosidad y la temperatura de las condiciones bajo las cuales se desarrollí: la ticnicli. I,& i.lectroforisis en gel de poliacrimida bajo condiciones no reductoras y en przsencia de dodesilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es una variante de los diferentes tipos di: clectroforésis que existen, se usa poliacrilamida como soporte debido a que t:ta formalin gel electricamente neutro, con un tamaño de poro regulable, esto es (que st: pusde iiicrmentar o disminuir el tamaño para poder separar proteínas pequeñas o pndcs (Klment 1990, McGilvery 1986). iii iicrilmiiida es im tiioiioinero que presenta la siguiente estructura: ('H '=C I-C-NH 2 0 1% presencia de radicales libres, que usualmente son suplementados por iimiili':ito de amonio y estabilizados por TEMED (N, N,' N'-Tetrametiletilendiamina). w fí)riiia nna rcncción en cadena, esta reacción inicia la polimerización de 19s iiioiioinc>ros Je ncrilnmida. Cuando esta reacción se lleva a cabo en presencia de N. N',-~(~tilenebisacrilamida, las cadenas de polimerización forman un gel <IC ciitr~criizaiiiiento, por lo tanto el tamaño del poro del gel está determinado por 1:i longitud de las cadenas y el grado de entrecnizamiento (Klement 1990). H H -CH FCH--C--N--CH z--n--c--ch=ch 2 o o N,N',-Metilenebisacril~ida

12 -CH z--ch--[ch z-ch-]n CH 2-CH c't CO NH 2 " (" 2 c o " -L'H z--c,'ii--[cii Z--CH--]n L'H 2-- CH--[CH z-cii-]n (7H 2- Cn C<) co MI NI I 2 PM 2 CI 2 NI1 ci, iititrecnizmiento de polincriiamida

13 ~ fuxori ~ ~ ~ siispención Y I 7 I. c 1V.- MATERIALES Y METODOS 11 I.., I CEPAS BACTERIANAS EMPLEADAS. Los microorganismos utilizados fueron la cepa bacteriana antagónica de Erwznia imheiphilu CAE-01, las bacterias patógenas Xianthornonas campestris pv. phaseoli y syringae pv. phaseolicola de la colección del laboratorio de! j>sz~~riomonas ; fitobacteriología de la Universidad Autónoma Chapingo. i! DETERMINAR SI EL ANTAGONISMO DE LA CEPA CAE-O1 D'E E. I 1 t~ne~reipízila ES DEBIDA A LA PRODUCCION DE SIDEROFOROS. I! Di: [in cultivo de E. trucheiphilu de 24 h en Agar Nutritivo (AN), se preparó una de aproximadamente 3x108 UFCimI. y diez mililitros de ésta suspensión transferidos a quinientos mililitros del niedio licuado agar-papa-dextrosa ti)i)a). Se tomaron dos mililitros y se vaciaron en el centro de una caja con PDA, a la cual previamente se le había hecho una perforación, este mismo procedimiento 52 j rcalizo con medio B de King, enseguida se incubaron a 25 C durante r;iiisciirriilo ese tiempo, sobre toda la superficie del medio de cultivo se iisperjh una suspciisióii de Xc pv. phuseolicola con 3XlO8UFCíml y se incubaron durante 48 I1 a 25C'C!. : PZIKIFICACION PARCIAL DE LA SUSTANCIA A"J,lkIICROB[AflA. I En un mcdio de cultivo semisolido papa-dextrosa-agar (PDA), contenido en Liii I ' matraz de 1üOO ml se adicionó una suspensión acuosa de la bacteria antagónica pm I ajustar 1 a una concentración aproximada de 3x108 UFC/ml y posteriormente se incubo I a 25'C diirante 72 horas, transcurrido este tiempo, se mezclo el medio de cultivo con un agitador magnético y se paso a través de un filtro de porcelana, al filtrado obtenido I 1 se le determinó su actividad antagónica por el método de difusión en disco, el cud I i

14 c 12..., 1 consiste en humedecer discos de papel filtro whatman # 1 (de aproximadamente 0.7 cm de diiímetro) con el filtrado, los cuales fueron colocados sobre la superficie de una caja con medio PDA que previamente había sido inoculado con la bacteria patógena, estas cajas se iiicubaron por 48h a 2S"C y después de este periodo se evaluó el halo de iiiliibioión SENSIBILIDAD DE LA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA A ENZIMAS Y A LA TEMPERATURA. P:ira determinnr la sensibilidad de la sustancia antimicrobiana a la actividad t'nzimitica, de lazona de inhibición desarrollada en los medios de cultivo se extrajeron v;irios discos de aproximadamente 0.8 cm de diámetro, los cuales se colocaron en tres mlucioiies enzimiiticas( de Tris, de acetato de sodio y de sodio), dejándose. incubar por L2íJ iniii a 37T, excepto para las muestras que tenían tripsina que fueron incubadas a L5'~'C Se rmliztuoii cinco repeticiones p a cada enzima Las eiiziiiias y sus buffer empleados fueron: tripsina (2mgimI) en 0.05 M Tris- HCL(pH 8); papaina (2 mgiml) en 0.05 M Na-COOH (ph 4.5)-0.2 M Nacl; lisozima (2 mg/mi), NaclO.8%.todas obtenidas de los laboratorios SIGMA. Los discos de ditímetro aproximado 0.8 cm, se colocaron en cajas de medio PDA y se 1t.s sometió a diferentes temperaturas( cuadro 1 ), posteriormente la bacteria patógena se asperjó sobre el la superficie del medio de cultivo y se dejó incubar por 72 ha 25'C.

15 ('iindro 1.- 'Iemperaturas y tiempo de exposición de la sustancia antimicrobiana imducida por la cepa antagónica CAE-01, para evaluar su estabiüdad térmica. Trn taitiiento Tiempo (Minutos) Tiempo (Minutos) 75 C 80 C 8S"C 911 C 100 C PINALISIS ESPECTROFOTOIiIIETRICO. IIc In zona de iiiliibición desarrollada en las cajas de petri, producto del :i!itn~oriistiio de la cepa CAEO1, se procedió a la extracción de discos de :.iprouimiidam2nte 1 cm de diámetro, los cuales fueron solubiiizados en un buffer de cloruro de sodio (O,85% w/v) ph 7 y posteriormente se centrifugaron a 12 O00 x g por 30 iiiinritos para remover los fragmentos de agar y las células bacterianas. La actividad aiitirriicrobiaiia de los extractos se evaluó por el método de difusión en disco. Los wiractos positivos se analizaron mediante un barrido espectrofotométrico de 190 ;I I l(i0 nm, en un aparato KIN-ELMER LAMBDA 2 UVMS DETERMINACION DEL NUIiIIERO DE FRACCIONES DE Id.\ SI ISTANCIA ANTIMICROBIANA. Una vez determinado el espectro de absorción de la sustancia antimicrobiana. bc decidió evaluar de cuantas fracciones podría estar constituida y si todas ellas tetiíhn actividad antagónica, por lo que se sometieron 4 ml de la solución parcialmente

16 Agüa FAuesíra. 14 purificada, en un buffer de cloruro de sodio(ph 7), a un fraccionador en columna, en a oel de dextrana (srphadex G-lü), para eluirlo con el buffer de cloriiro de sodio (0.80 1% w'v, con un ph 7.0j. I,ns fracciones proteicas del eluente se determinaron tomando en cuenta los reiiiltados del andisis espectrofotométrico, esto es a 280 nrn. Las fracciones obtenidas se liofilizarón y se determinó su actividad antimicrobianapor el método de difusión en rllnoo. -!.7.-T:ETE~hIIN~~IOlI DE PfZO'i'EINAS. Para la determinar la concentración de proteínas en la sustancia antimicrobiana pmiialmente purificada, se empleo el método de BCA (Smith et al 1985) modificado, utilizando BSA para construir la CWR estmdar (Apéndice A) (cuadro 2). j BSA I BSA DI ~ (mi) ~ Hltaclivo C Horno de microondas I Absorbancia 1 ( 'tindrn 2. C!urva eitándar para la determinación de proteínas SDS-PAGE. La separación electroforética se realizó en un gel de poliacrilamida al 12%, ds acuerdo al protocolo de Laemmli (19701, en presencia de SDS y bajo condiciones no

17 . 13 fcductoras {Apéndice B). Las proteínas se visualizaron utilizando azul de Coomassie (Firbanes y col 1980). 'I'iiiiibih se utilizó la tiiicióii de plata para visualizar los coinponentes meiiores, Iiara esto una vez que se corrió la electroforésis, la placa se colocó en una solución al li)oh alcohol isopropilico/lo% ircido acético por una hora, posteriormente se decantó t;;ta solución y se le adicionó glutaraldehido al lo%, durante 1 hora, posterior a esto se lavó con aguadesionizadapor wa hora, reeliznndo cu&o cambios. i)sspui.s de esto se realizó la íincióii con una solución amoniacal de plata reciin prspartida, una vez obtenido el resultado deseado, la placa se suspendió en una soliición de ácido acético al 10% pnra conservnción del gel.

18 7,,.. 16 V.- RESULTADOS Y DISCUSION DETERMINAR SI EL ANTAGONISMO DE LA CEPA CAE-O1 DE E. tracjukhila ES DEBIDA A LA PRODUCCI~N DE SIDEROFOROS. BAido a que el halo de inhibición de las bacterias patógenas por efecto de la antagónica, no se presentó cuando se empleó del medio de cultivo B de King, siendo muy ni:ircado en las caja con PDA, se descartó la acción de los sideroforos ya que.de acuerdo a Sigee (19931, estos compuestos son activados genéticamente cuando las 1i:icterias se encuentran en un medio deficiente de hierro como lo es el medio antes n~~:ncioi~ado. Es importante mencionar que el medio de cultivo PDA, no es propicio para el crecimiento de la cepa antagónica CAE-O1 de Erwinia tracheipk.da; sin i.i:ih;irgo, lir actividad inliibitoria de las células que van en el disco es muy marcada y L;tT rniinif iesta aíin cuando no se multiplique, descartando así la posibilidad de que se trnte de la competencia por nutrientes o por espacio, sino más bien que se encuentra iiivoliicrda una sustancia soluble en agua y de fkil difusión en el medio de cultivo PCTRIFICAC!ÓN PARCIAL DE LA SUSTANCIA ~fitihiicrobi=\na. Cuando la bacteria patógena se sembró en el medio de caldo nutritivo. para facilitar la separación de la sustancia inhibitoria de la población bacteriana a traves de I;i filtración Millipore, no se logró obtener ningún efecto inhibitorio sobre las bacterias patógenas, cuando sobre ellas se colocaron discos humedecidos en el filtrado, posiblemente se debió a que algunas sustancias inhibitorias del crecimiento, sólo : 5 producen cuando se encuentran en un medio sólido como lo sugiere Wanda y c.olaboradores (1991); sin embargo, también podría deberse a que esta sustancia plido ser retenida por efecto de carga de la celulosa de 10s filtros Millipore.

19 c 17 Debido a que este método no dio los resultados esperados, se procedió autilizar 21 medio de cultivo PDA (con la mitad del agar recomendado) y después de un periodo de inciibación de 72 hs a 25"C, la sustancia inhibitoria secretada al medio se purificó, haciendo un filtrando a1 vacío, empleando ahora filtros de porcelana (Pyrex), el cual dio resultados positivos, esto es, cuando se probó este filtrado sobre cultivos de X c. pv. phaseoli y P. s. pv. phaseolicola se presentó el halo de inhibición SENSIBILIDAD DE LA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA A Ei. ím4s Y A LA '1EMPE.RATURA. Ai ileterniinar que la bacteria antagónica produce una sustancia inhibitoria difusible til el medio de cultivo, se procedió a obtener discos de agar de aproximadamente 0.8 ciii de diimetro, de la zona de inhibición para someterla a la acción de j)$ipa tia y lisosima, enzimas 'IC tripsina, que catalizan la hidrólisis de los enlaces intermediarios las cadenas polipeptídicas, transfiriendo el grupo acilo del péptido a un residuo de sxiiia, cntonces este intermediario acil-enzima, se rompe por la entrada de una inoiectiia de agua (McGilvery I986), esto sucedería lógicamente si la sustancia i!ivoiiicrada en el antagonismo fiiera de carácter proteico, ya que una proteína (b:ictl~riocina) está formada por cadenas polipeptidicas, las cuales son formadas a partir de Is unión de aminoácidos mediante enlaces amida, entre el grupo amino de una ttiol6cula y el grupo carboxilo de otra, esta repetición del enlace amida que une los átomos C-2 de los residuos de aminoácidos sucesivos es el substrato de las enzimas niites mencionadas, sin embargo en los ensayos realizados en el presente trabajo logró determinar que dicha sustancia no era sensible a estas enzimas, lo que nos podría sugerir por el momento que su naturalezano es proteica y nos estaría indicando la posibilidad de un antibiótico ya que de acuerdo a Sigee (1991), estos compuestos son resistentes a la degradación enzimática debido a que en su conformación química estructural no cuentan con polipéptidos, los antibióticos tipo bacteriocina son se

20 cvrnpuestos tipicamente cíclicos que carecen del enlace peptídico necesario para la acciih de las enzimas antes mencionadas. Sin mbargo dicha prueba no se considero suficiente para descartar a las bricteriocinas ya que cxisten referencias donde se menciona qiie hay proteinas rrsistentes H proteasas (Wanda, 1991, ). Debido a que con esta prueba no podemos descartar a los antibióticos, ni a las bacteriocinas, fue necesario implementar otra serie je ensayos ptua poder descifrtu IR naturaleza de IR sustancia buscada [in parkmetro de gran utilidad recomendado en la literatura, es el análisis de la termo estabilidad de las moléculas, ya que para el caso de los antibióticos, estos son i.ii::tiiiic Z muy sensibles al incremento de la temperatura, sin embargo las bacteriocinas se Iia encontrado que son muy termo estables. ;\I someter la sustancia iiihibitoria producida por Erwinia tracheiphila CAE-O1 a las :litas temperaturas, se determinó que tiene una alta resistencia a este parámetro ya que qoportó la exposición durante seis minutos a la temperatura de 100 C. Este parámetro c uno de los indicios que nos permiten suponer que la sustancia involucrada en el niccmismo de tmtibiósis podría tratarse de proteína ANALISIS E.SPECTROFOTOMETRIC0. Una vez que se logró la purificación de la sustancia inhibitoria, producida por la ccpn CAE-O1 de E. tracheiphila, esta se sometió a un análisis espectrofotomitrica rrdizado en el intervalo nm, utilizando el medio original (PDA) como blanco, para evitar que los constituyentes de este medio representen una fuente de absorción y por lo tanto iiiterfieran con los propósitos establecidos, así el resultado del análisis sólo será la sustancia responsable de la inhibición de los patógenos probados. Los resultados obtenidos indican que la sustancia antimicrobiana cuenta con un espectro de absorción que oscila entre los nm (Fig. I), también nos dice que

21 -- I *. podem os descartar compuestos que tengan absorbancia significativa a longitudes de ontlapor arriba de los 300 nm, entre los cuales se encuentran algunos antibióticos que poven compuestos de nahualeza cíclica Lunniliid de i,nda (nin). Fi13.i. Barrido espectrafotoiiibtrico de la sustancia antimicrobiana I)ETERbIINACION DEL NUMERO DE FRACCIONES DE LA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA. Puesto que el análisis espectrofotométrico obtenido indicó que la sustancia antiniicrobiana contaba con espectro de absorción entre nm y que es muy temo estable nos daba posibilidades de que en el efecto inhibitorio estuviera iiivolucrada una sustancia de tipo proteico, ya que las proteínas (bacteriocinas) tienen

22 20 1 un pico de absorción pronunciado a los 280 nm y son muy termo estables, por lo tanto la siguiente metodología fue canalizada hacia el ensayo de proteínas. 4 in1 de la soiiicií,n pwrciiilmente purificada se incorporaron a una columna en gel de dextrann (sephndex G-IO), con este untilisis se determinó que la sustancia ;iritirnicrobiana podría estar constituida por dos fracciones, una de las cuales se imcuentra en mayor proporción que la segunda y además es la única que tiene actividad antimicrobiana (Fig. 2); sin embargo al comparar, el diámetro del halo de inhibición de la sustancia cruda y la fracción purificada, el halo es más grande en la yrimsra TIRACCION EL-A FIG. 2. Eludón de la sustancia antimicrobiana en la columna con sephadex GIO OETEKMINACION DE PROTEINA. Determinaaón de proteínas. La curva estandart realizada para la cuantificación de proteínas por el método de BCA nos indica que Erwinia trachelphiia cepa CAE-O1 produjo mg de proteína (inhibidor) por 10 ml de medio de cultivo, a partir de una suspensión de 3 x 10 8 UFC/ml en 72 horas de incubación (Fig 3)

23 1. 21 I C O N C ENTRA C I O N(mgl L) FIG. 3. Curva estandart para la cuantificadón de proteínas SDS-PAGE. Cuando la fracción activa (pico 2) eluida apartir de sephadex G-10 fue sometida a zlnctroforésis en un gel de poliacrylamida al 12%, se logró visualizar una banda significativa de proteínas (Fig. 4). como muestras control se utilizó tripsina y liquido folicular, visualizando las proteínas con azul de coomassie. AI utilizar la tinción con phta (Fig. 5) y utilizando tripsina y marcadores de peso molecular como referencias. se logró obtener los mismos resultados. Lo que implica que es una sola especie niolecular la responsable de la actividad bactericida

24 . 22 Fig.J.-SUS-PAGE clsuaüzada con Fig. 5.- SDSPAGE visualizada con tinción de azul de coomassie, tinción de plata mostrando: 1, mostrando: 1, la proteína buscada, 2, fracción 1 de la proteína buscada, liquido foiicular, 3, tripsina. 2, fracción 2 y 3, anhidrasa carbonica

25 c 23 VI.- CONCLUSIONES 1.- La sustancia antimicrobiana producida por Erwinia trachejphila cepa CAE- O 1 tiene un comportamiento espectrofotométrico que oscila entre mn. 2.- Al separar sus fracciones, esta se divide en dos grandes picos de absorción, de los cuales sólo el primero cuenta con actividad antagónica 3.- La muestra cruda presenta más actividad antimicrobiana que cuando es separada (primer pico de absorción). 4.- La sustancia iiihibidora producida por Emjnia tracheiphila cepa CAE-01 in vitro, es una proteína con peso molecular relativo sitiiiltv RI de In tripsina (16 O00 Daltones) 5.- Esta proteína es termoestable, y no es sensible a las proteasas evaluadas. 6.- Estaprateína antimicrobiana es muy tmnoestable, ya que a 100 C düraiik 6 minutos conservó su actividad 7 - La cepa bactenana antagónica cae-01 de mg. de inhibidor por 10 ml de medio de cultivo. Emma tracheiphila produce S.- Ciimdo se aplica auna electroforésis lahcción separaday que de acuerdo al resultado de la difusión en disco, esta fracción es activa, la,.lorn "n" miimrrh-o m.m rii.3"ko" -1,.Apuwa uva iiiubaua qub A ~ I u lil ~ bnudtü J Cnido

26 . está compuesto por varias proteínas, el eluido está formado de un sólo tipo proteico, además esta bandaproteica tiene un patrón electroforético similar al de la tripsina 9 - Se desmollo una metodología simple de producción, purificación y caracterización de una proteína producida por la cepa CAE-O1 de Erwinra tracheiphda que tiene actividad bactericida hacia bacterias patógenas. VIL- ACTIVIDADES REALIZADAS Pwte de el presente trabajo fue presentado en IR 111 Reunión Internacional Sobre Manejo Integrado de Plagas: Ornamentales y Hortalizas. Realizada del 6-8 Noviembre de 1995 en la Universidad Autónoma Chapingo, Chapingo, México. VII1.- RECOMENDACIONES Toiiiando en cuenta que tonto la bacteria antagónica como la proteína que sintetiza, presentan actividad bactericida, sería de gran importancia realizar:.- Andisis de los ácidos nucleicos de labacteria.- Secuencia de aminoácidos de la proteína.-localizar el origen de esta proteína..

27 1X.- APENDICE APENDICE A Soluciones para la deterniinaáón de proteínas por et método de BCA. Solución A. solución B. 2?4 carbonato de sodio. 4% CUSO 4.5H20. DCA O. 16% tnrtrato de sodio 0.4'!& NttoH i~.~í% bicarbonato de sodio íi&i desionizada SY njustael pha11.25 connaohonahc0 3 Se iiiezclaii SO partes del reactivo A más 1 parte del reactivo B, paraobtener el reactivo c. :;e 8grega 1 ni1 de reactivo C a 50 pi de mesúa o de la curvapatrón. Se calienta 20 spndos al homo de microondas con los controles puestos a 700 W.

28 . 26 APENDICE B Soluciones para la electroforésis de acuerdo al protocolo de Laemmii. (;el da sepwación Cmtidades Gel de empaquetamiento Cantidades 30% stock de acrilamida 10 ml Agua ?ó SDS 0.25 ll5 M Tris-Hcl ph % TEMED lh 41s O?? stock 1 ml Agua % SDS o M Tris-Hcl ph % Temed O?! Aps ml 10 ml El persulfato de amonio (APS) al lo%, debe ser preparado al momento de usarse, 0.1 glml. Bt&r de dl~itruja (5x) Ltuitiddes SPB Cantidades 0.25 M iris g 1.0 M Tris-HCI ph ml 1.92 M Glycina % SDS ',<* SDS 20.0 Glycerol 0.43 Agua a4 L. Agua % ani1 de bromofenol 0.03

29 . 27 APENDICE C. 'Tinción del gel tie polyacrüamida por el método de azul de coomassie. Solución A Solución B. Solución c. 2YKJ De iiicoi1ol 10% De alcohol 10% De ácido acetico. isopropilico isopropilico li!'!4 De Acid0 acetic0 O.í125'!4i x5ul de cooriiassie 10% De &ido ncetico % mlde coomassie ST jirepiunroii las soluciones A, B y C (Apéndice Cj, el gel se tiñó con la solución A tluraiite toda la noche, posteriormente se destiño primeramente con la solución B por 1111 periodo de 3 horas, completándola con la solución C, hasta obtener la clarificación iottl\ JSl se.

30 c Soluciones para la tinción de plata. APENDICE D. solución aiioiitacal de plata Solución de desarrollo 21 in1 de una solución 0.30% NmH 300mldeH 2O (w iiil da NI3 ZOH 4 nil de AgNO 3 al 20% (Wh) Solución de fijación 30 mg ácido citric0 150 pi de formaldehydo al 37% Solución de conservación 1 í) C ir;opropaiol/l0% ácido acetico 10% ácido acetico 1 V% gliriaraldehido I nvrido(qua)

31 c 29 x.- BIBLIOGRAFÍA Agrios, N.G. (1987). "Pi:int Pathology". ACADEMIC PRESS. London, England. pp ~?&stef, M., Eallcstcf, J. M. and Eelaich, J. P. (1937). Isolation and characterization of a high molecular weight antibiotic produced by a marine bacterium. Microbioal I ~ o ~ o ~ 3: Y ~ ui> f t o R..,, Xocoiiugtle, C.B., Alvarez, M.A. (1990). "Programación genitica de 1'' i>!;mta e insecticidas". ICYT. México, D.F. pp Fknder. CL. and LooRscy, D. A. (1386). Indigenous plasmids in Pseudomonüs s,$>i.::~,qcle pv. tomato: conjugative transfer and role en copper resistance. J. Bacteriol. Ihí: Ikicfoot, S. F., arid T. K. Kiacuhammer. (1983). Detection and activity of!ac!ac:n U, u biicteriocin produced by Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 45: 1ROEI-15. bdfixd, hí. M. (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities o f protein utilizing the principle of the binding. Analitical Biochemistry. 72:

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