ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA INFORME DE INVESTIGACIÓN TIPO I


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1 ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA INFORME DE INVESTIGACIÓN TIPO I EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE LAS HOJAS DE CLINOPODIUM TAXIFOLIUM chinininga FRENTE A LAS CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y KLEBSIELLA PNEUMONIAE IN VITRO AUTORAS: Bamberger Vazallo, Karla Lizbeth Collave Alvarado, Susan Rocio ASESOR: Msc. Hugo E. Casanova Herrera CO - ASESOR: Mblgo. Gerardo Alayo Espinoza TRUJILLO PERÚ 2010

2 DEDICATORIA Dedico este trabajo con gratitud a Dios, nuestro creador y redentor por darme salud, felicidad, paciencia, y las fuerzas necesarias para poder alcanzar mis metas y objetivos y por iluminar mi camino futuro, y todo lo necesario para concluir nuestro trabajo investigativo el cual necesito de mucho esmero y dedicación. (Karla) A mis queridos padres, GLORIA y ANGEL, por todo su amor y confianza que depositaron en mí persona, el deseo de verme como triunfador hace aun más valiosa su cooperación. Me siento orgulloso de tenerlos siempre a mi lado, por ser ejemplo de esfuerzo, trabajo, perseverancia y símbolo de superación que ahora me permite llegar a cumplir uno de mis sueños de los cuales estaré eternamente agradecido. (Karla) i

3 A Dios y a la Virgen de la Puerta, por el camino recorrido, por ser mi guía, fuerza, templanza, apoyo y perseverancia Para ti!!! mi vida!!! (SUSAN) Especialmente a mis padres JOSÉ Y JUANA porque representan lo más grande que tengo en la vida y ustedes me han sabido formar y apoyar en todo lo necesario para seguir adelante, y que gracias a su cariño y comprensión ahora me permite cumplir una de mis metas, el de ser profesional, porque han estado conmigo en todo momento dándome ánimo y cariño! Para ustedes con todo mi corazón!!!.. (SUSAN) A mis familiares: Mi Hermano Bladimiro; Mis sobrinos: Elian, Marissa, Abigail; Mi abuelita Erceliz; Mi Abuelito Artemio en el Cielo; Mis Tíos y Primos por haberme demostrado su cariño y apoyo incondicional en los momentos más difíciles, por robarme una sonrisa cuando más lo necesitaba y por ser parte de mi entorno... Para ustedes con todo mi cariño!!!... (SUSAN) A todas Aquellas Personas que de una u otra manera han sido apoyo y estímulo de superación, que con su Amor, Amistad, Fe y Confianza me han demostrado que hay muchas razones para ser Feliz...Para ustedes mi Amor y Cariño!!!... (SUSAN) ii

4 Agradecimientos A ti Señor: Gracias por guiar nuestros Caminos y permitir que nuestras metas sean logradas. Gracias por el inmenso amor que nos tienes, Por tus bendiciones y el regalo de la vida. A nuestros padres: Desde lo más profundo de nuestro corazón mil gracias por su compresión, por sus sabios consejos, y por su ayuda incondicional para hacer realidad uno de nuestros más hermosos sueños, El ser profesional. Un especial agradecimiento a la Cátedra de Química por la confianza y el apoyo brindado, para que este trabajo se realice. iii

5 PRESENTACIÓN Señores miembros del jurado: Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento para la obtención de GRADOS Y TITULOS DE LA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO, presentamos a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de investigación Tipo I titulado EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE LAS HOJAS DE CLINOPODIUM TAXIFOLIUM chinininga FRENTE A LAS CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y KLEBSIELLA PNEUMONIAE IN VITRO, con el que pretendemos obtener el TITULO PROFESIONAL DE QUIMICO FARMACEUTICO. Dejamos a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del presente trabajo. Trujillo, Octubre del 2010 Karla L. Bamberger Vazallo Susan R. Collave Alvarado iv

6 JURADO DICTAMINADOR Mg. William Sagástegui Guarniz PRESIDENTE Mg. Gilmer Zari Gil MIEMBRO Mg. Hugo E. Casanova Herrera MIEMBRO v

7 INDICE PAGINAS PRELIMINARES Dedicatoria... i Agradecimiento... iii Presentación...iv Jurado Dictaminador... v Índice...vi Resumen... vii Abstract... viii I. INTRODUCCIÓN... 1 II. MATERIAL Y MÉTODO... 8 III. RESULTADOS IV. DISCUSIÓN V. CONCLUSIONES VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS VII. ANEXOS vi

8 RESUMEN Mediante el presente trabajo titulado Efecto de los Extractos de las hojas de Clinopodium Taxifolium Chinininga frente a las cepas de Staphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae in vitro se realizó con la finalidad de determinar su efecto antibacteriano sobre las cepas de Staphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae para comprobar el uso tradicional de dicha planta contra enfermedades respiratoria agudas. Para la obtención de los extractos se utilizó los extractos con solventes de polaridad creciente: hexánico, etanólico y acuoso; cuyos extractos sirvieron para determinar su efecto sobre: Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae. Según el método difusión de Kirbi Bauer modificado que por difusión de una muestra a través de una capa de agar solidificado en una extensión, el crecimiento de microorganismos sensibles es inhibido alrededor de la zona que contiene una concentración conocida del extracto hexánico, etanólico y acuoso de la Clinopodium taxifolium Chinininga. De los ensayos correspondientes se obtuvieron los siguientes resultados: Para el extracto hexánico se obtuvo mayor halo de inhibición de 12mm a 18mm para ambos microorganismos; para el extracto etanólico se obtuvo halos de inhibición de 10mm a 12mm y para el extracto acuoso de 9mm a 11mm. De los resultados obtenidos se concluye lo siguiente: el extracto hexánico mostró mayor halo de inhibición que el extracto acuoso, siendo el tamaño de 12 mm a 18 mm y de 10 mm a 12 mm para Klebsiella Pneumoniae y Staphylococcus aureus respectivamente; además a mayor cantidad y concentración de los extractos el efecto antibacteriano será mayor siendo Klebsiella Pneumoniae el más sensible. Palabras claves: Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Clinopodium taxifolium Chinininga, infecciones respiratorias agudas, extracción, efecto antibacteriano. vii

9 ABSTRACT Through this work entitled "Effect of Extracts from the leaves of Clinopodium Taxifolium" Chinininga "against strains of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae in vitro was performed in order to determine their antibacterial effects on strains of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae to verify the traditional use of the plant against acute respiratory disease. To obtain the extracts were used extracts using solvents of increasing polarity: hexane, ethanol and aqueous extracts of which were used to determine its effect on Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. According to Bauer kirbi diffusion method modified by diffusion of a sample through a layer of agar solidified, to an extent, the growth of sensitive organisms is inhibited around the area containing a known concentration of the hexane extract, ethanolic and aqueous Clinopodium taxifolium the "Chinininga." Corresponding tests yielded the following results: For the hexane extract obtained higher inhibition zone of 12mm to 18mm for both microorganisms, for the ethanol extract was obtained halos of inhibition of 10mm to 12mm and for the aqueous extract of 9mm to 11mm. The results obtained showed that: the hexane extract showed higher inhibition halo of the extract, and the size of 12 mm to 18 mm and 10 mm to 12 mm for Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus respectively, in addition to more concentration of the extracts and the antibacterial effect will be greater Klebsiella pneumoniae being the most sensitive. Keywords: Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Clinopodium taxifolium "Chinininga, acute respiratory infections, extraction, antibacterial. viii

10 I. INTRODUCCIÓN El ser humano, desde tiempos inmemoriales, está expuesto a una innumerable variedad de microorganismos patógenos que le han causado diversas enfermedades, muchas de ellas de curso mortal. A fin de controlar o eliminar a estos microorganismos, el hombre ha utilizado y permanece en la continua búsqueda de diversos métodos de control de tipo físico, químico e incluso biológico; teniéndose entre los métodos biológicos el uso tradicional de plantas con propiedades medicinales La Organización Mundial de la Salud considera como planta medicinal todo vegetal que contiene, en uno o más de sus órganos, sustancias que pueden ser usadas con finalidades terapéuticas o que son precursoras de la semi síntesis químico-farmacéutica y estima que el 80% de los más de millones de habitantes de la tierra las utilizan en la medicina tradicional 3, 4. Teniendo en cuenta que hay por lo menos especies de plantas superiores en la Tierra, es lógico asumir que muchas más drogas útiles serán encontradas en el reino vegetal. Las plantas contienen un gran número de sustancias con propiedades inhibitorias de las actividades metabólicas de bacterias, levaduras y mohos, reportándose más de 1340 plantas como potenciales fuentes de antimicrobianos, encontrándose principalmente los compuestos antimicrobianos presentes en extractos y 1, 2. en aceites esenciales obtenidos a partir de hojas, flores, bulbos, rizomas y frutos. Estos compuestos pueden ser letales para las células microbianas o simplemente servir como inhibidores de la producción de metabolitos 4,5. 1

11 A pesar de que han aumentado las investigaciones y estudios científicos de las plantas medicinales, se conoce poco de los principios activos a los que deben las plantas sus extraordinarias cualidades, por lo que la ciencia moderna busca conocer cuáles son los principios activos responsables de sanar las enfermedades, determinar su estructura química, procurar su síntesis, proponer modificaciones estructurales en busca de una mayor efectividad; es entonces, de gran importancia localizar los principios activos en las diferentes partes de las plantas para poder aislarlos 6,7. La mayoría de los compuestos vegetales con actividad antimicrobiana son compuestos fenólicos, terpenos, alcoholes alifáticos, aldehídos, cetonas, ácidos e isoflavonoides. La mayoría de estos compuestos son identificados como metabolitos secundarios, enzimas hidrolíticas (glucanasas, quitinasas) y proteínas que actúan principalmente sobre las membranas celular, pared celular, enzimas metabólicas, síntesis de proteínas y el sistema genético, siendo todos estos estructuras o vías estratégicas para la supervivencia de los microorganismos 4, 6,7. La importancia de las plantas medicinales se hace más latente en los países en vías de desarrollo. El empleo de las plantas medicinales en el Perú es una práctica popular de gran arraigo desde la época prehispánica. En la actualidad el empleo de las plantas medicinales está muy difundido sobre todo en las zonas suburbanas y rurales de la costa, en toda la sierra y selva peruana 8. En algunas comunidades de la provincia de Santa Cruz, departamento de Cajamarca, se viene utilizando empíricamente las hojas Clinopodium taxifolium Chinininga, como antileishmanicida y para el tratamiento de enfermedades respiratorias. La población utiliza las hojas de ésta planta aplicando directamente sobre el área infectada como infuso. 2

12 La clasificación adoptada para la especie en estudio, está basada en el sistema de clasificación filogenético de Adolph Engler publicado en la XII Edición del+ Syllabus Der Pflanzenfamilien del año El Clinopodium taxifolium Chinininga (Kunth) Govaerts, especie que pertenece a la familia Lamiaceae; es un arbusto anual o perenne, aromático, de tallos y ramas generalmente de 4 ángulos, sus hojas son opuestas, rara vez alternas, simples y sin estípulas. Posee en general inflorescencias compuestas, a veces flores solitarias y axilares. Habita en laderas a una de altitud: m.s.m 9. Las infecciones respiratorias agudas (IRA) representan un importante problema de salud pública en los países en vías de desarrollo, donde 4.3 millones de niños menores de cinco años son afectados cada año. Esto ocasiona de 20 a 60% de consultas pediátricas en las instituciones de salud, y causa 0.8 millones de muertes anuales en los menores de un año. En 1990, en México los fallecimientos por IRA ocuparon el primer lugar como causa de muerte en menores de un año, y el segundo en niños de uno a cinco años. En nuestro medio las IRA constituyen la primera causa de demanda de atención para menores de cinco años (Minsa). El mayor número de casos notificados de infecciones respiratorias agudas (IRA) se concentra en las regiones San Martín, Ancash, Junín, Huánuco, Apurímac, Andahuaylas, Ayacucho, Cajamarca, Cusco e Ica 10,11,12. Dentro de las infecciones que afectan el tracto respiratorio inferior, la neumonía es la principal causa de consulta médica, cuyos agentes etiológicos que la producen son: S. pneumoniae en un 60 %, M. pneumoniae y K. pneumoniae. Dentro de los agentes bacterianos en las infecciones adquiridas en la comunidad los microorganismos más comunes son Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus 13, 20. 3

13 S. aureus es un microorganismo de gran importancia médica. Desde hace muchos años se le ha reconocido como uno de los principales agentes patógenos para el humano. Posee un alto grado de patogenicidad y es responsable de una amplia gama de enfermedades. Produce lesiones superficiales de la piel y abscesos localizados en otros sitios. Causa infecciones del sistema nervioso central e infecciones profundas como osteomielitis y endocarditis. Es causante de infecciones respiratorias, infecciones del tracto urinario y es la principal causa de infecciones nosocomiales. Provoca intoxicación alimentaria al liberar sus enterotoxinas en los alimentos y produce el síndrome del shock tóxico al liberar superantígenos en el torrente sanguíneo, además produce septicemia, impétigo y fiebres 14,15. Klebsella pneumoniae es la especie de mayor relevancia clínica dentro del género bacteriano Klebsiella, compuesto por bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae, que desempeñan un importante papel como causa de las enfermedades infecciosas oportunistas. La Klebsiella pneumoniae, dentro de este género bacteriano, está implicada principalmente en infecciones nosocomiales. Es el agente causal de infecciones del tracto urinario, neumonías, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirúrgica. Causa alrededor del 1% de las neumonías bacterianas y puede causar condensación hemorrágica extensa del pulmón 16. El mal uso de los antibióticos ha traído consigo la resistencia bacteriana que es un fenómeno creciente caracterizado por una refractariedad parcial o total de las bacterias al efecto del antibiótico generado principalmente por el uso indiscriminado e irracional de éstos y no sólo por la presión evolutiva que se ejerce en el uso terapéutico. Las infecciones causadas por bacterias multirresistentes causan una amplia morbilidad y mortalidad. Asimismo causan un mayor costo por mayor estancia hospitalaria y 4

14 complicaciones, lo que hace necesario la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas para dichas infecciones En cuanto al efecto antibacteriano de plantas sobre microorganismos, existen estudios como los realizados en Cuba, donde los extractos alcohólicos de hojas y corteza de Polylepis australis Bitter (queñoa) que son utilizados tradicionalmente para enfermedades infecciosas de vías respiratorias en Tucumán, fueron enfrentados a cepas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, el cual resultó bactericida contra S. aureus y bacteriostático contra P. aeruginosa 18. En el Perú existen estudios como los realizados en cinco plantas empleadas en medicina tradicional: Eucaliptus globulus, Labill eucalipto ; Cimbopogon citratus, Hierba Luisa; Taggetes pusilla Lag., Anís Serrano ; Senecio thephrosioides, Turcs Huamanrripa y Lepechinia meyenii Epling Salvia. Los aceites esenciales se obtuvieron por arrastre de vapor y se enfrentaron a diversas cepas, mostrando efecto variado sobre Gram positivos y Gram negativos 19. En investigaciones realizadas por Uriol en el año 1998 se encontró que la Uncaria tomentosa uña de gato tuvo efecto inhibitorio del crecimiento in vitro de cepas de Shigella flexnerii, Staphylococcus aureus y Salmonella Typhi. Así mismo Santos y Villanueva en el año 2000 encontraron que el látex de Croton baillonianus var. pachyphyllus cabe cabe posee actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli enteropatógeno, Salmonella tiphy y Pseudomonas aeruginosa. Vigo en el 2005 en estudios realizados con aceites vegetales de Satureja sericeae shalgarromero encontró que éste tiene efecto inhibitorio sobre el Streptococcus β hemolítico del grupo A. También encontró que Klebsiella sp fue sensible frente al aceite de Mintosthachys tomentosa muña. 5

15 En la Universidad Nacional de Trujillo se han realizado estudios como el de Guevara B. (1997) titulado: Efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Minthostachys mollis grisebach muña sobre Eschericha coli, Shigella flexneri,salmonella typhy y Vibrio cholerae, que por el método de destilación con arrastre de vapor de agua logró demostrar el efecto antibacteriano en dichos microorganismos, siendo el Vibrio cholerae el microorganismo màs sensible al aceite esencial de Minthostachys mollis 20. Por tal razón, considerando que, los productos naturales constituyen una alternativa para combatir diversas enfermedades infecciosas frente al ataque de bacterias y dado que el Perú posee una extraordinaria y variada riqueza de plantas con aplicaciones terapéuticas en el ámbito folklórico, entre ellas Clinopodium taxifolium Chinininga, la cual existe en La Esperanza, Santa Cruz Cajamarca; y no existiendo información científica que sustenten el uso de dicha planta, es nuestro interés determinar su actividad antibacteriana, para lo cual nos planteamos el siguiente problema: Cuál es el efecto de los extractos de las hojas de Clinopodium taxifolium Chinininga frente a las cepas de Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae In Vitro? 6

16 En la presente investigación queremos alcanzar los siguientes objetivos: 1. Preparar los extractos que contienen metabolitos de las hojas de Clinopodium taxifolium utilizando solventes de polaridad creciente: hexánico, etanólico y acuoso. 2. Determinar la actividad antibacteriana de los extractos de las hojas de Clinopodium taxifolium frente a cepas de Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae In Vitro. 7

17 II. MATERIAL Y MÉTODO 2.1. MATERIAL BOTÁNICO Se recolectó 1 Kilogramo de las hojas de la planta Clinopodium taxifolium Chinininga en la localidad de La Esperanza, Santa Cruz, Cajamarca. Se seleccionó las hojas, eliminando todo elemento extraño, de inmediato se procedió a la extracción CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Se procedió a la identificación y clasificación taxonómica de la especie recolectada, en el Herbarium truxillensis de la Universidad Nacional de Trujillo MATERIAL MICROBIOLÓGICO Cultivos puros de Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae proporcionados por el Laboratorio de Bacteriología del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS Se procedió a la preparación de los extractos con solventes de polaridad creciente, hexano, etanol y agua, los cuales por maceración, calor y filtración se obtuvieron en forma secuencial, los cuales sirvieron para el enfrentamiento con las cepas en estudio. Luego se taparon herméticamente y se conservaron en refrigeración para su posterior evaluación. 8

18 FUNDAMENTO: El método para la obtención de los extractos de plantas medicinales descrita por Q.F. Hugo E. Casanova Herrera, consiste en poner en contacto la droga con solventes de diferente polaridad, bajo determinadas condiciones, logrando solubilizar los metabolitos secundarios que esté presente. Se fundamenta en los efectos de polaridad de los solventes, el ph y la temperatura del medio sobre la solubilidad de los metabolitos secundarios de las plantas medicinales; es decir que las fuerzas intermoleculares, además de afectar los puntos de ebullición y de fusión de las sustancias, determinan las propiedades de solubilidad de los compuestos orgánicos permitiendo la separación de los metabolitos secundarios, utilizado en el trabajo de investigación realizado por Sánchez R., Rabanal N. Determinación de los Metabolitos Secundarios del Látex de Euphobia Weberbaueri (La Lechera) ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS 21, ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA POR EL MÉTODO DE DIFUSIÓN DE KIRBI BAUER MODIFICADO Este método se fundamenta en la difusión de una muestra a través de una capa de agar solidificado, en una extensión tal que el crecimiento de microorganismos sensibles es inhibido en zonas alrededor de la zona que contiene una concentración conocida del extracto de la Clinopodium taxifolium Chinininga. 9

19 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Se tomó cuatro colonias del cultivo original de cada germen a ensayar con el asa bacteriológica y se suspendió en 5 ml de solución salina fisiológica. Se dejó en reposo hasta alcanzar una densidad bacteriana similar a la turbidez del tubo N 3 de Nefelómetro de Mac Parland (900 millones de bacterias por ml) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO En el caso de Sthaphylococcus aureus y Klebsiella Pneumoniae se utilizó como medio de cultivo agar nutritivo DIFCO. Se vertieron 20 ml en placas petri hasta obtener un grosor homogéneo de aproximadamente 4 mm de espesor. Las placas fueron mantenidas a 37 en una estufa, durante 60 min con la finalidad de eliminar la humedad de la superficie SIEMBRA DE LAS PLACAS Mediante una pipeta estéril, se vertieron 2 ml del inóculo sobre las placas de agar nutritivo sobre la superficie de las placas petri. Se realizó la siembra con el asa de Digralski; se inclinó y se eliminó el exceso con una micropipeta. Se dejó secar de 3 a 5 minutos antes de depositar el extracto de Clinopodium taxifolium Chinininga. 10

20 APLICACIÓN DEL EXTRACTO En las placas sembradas, previamente se realizaron 4 pequeños hoyos de 3 mm. de diámetro en donde se vertieron 10, 20,30 y 40 µl del extracto de Clinopodium taxifolium Chinininga con sus respectivos extractos. Una vez depositados los extractos, se procedió a sellar cada hoyo con agar. Luego, las placas se colocaron a 4 C por un tiempo de 15 minutos. A continuación, se dejó 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se colocó en incubación aeróbica a 37 C durante 24 horas. Para Sthaphylococcus aureus y Klebsiella Pneumoniae se procedió de la misma manera. Se realizaron cuatro ensayos por cada extracto en cada bacteria. Así mismo se hizo 2 ensayos denominados blanco con hexano y etanol para cada microorganismo MEDIDA DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN Transcurridas 24 horas se midió el halo de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus aureus y Klebsiella Pneumoniae y los resultados fueron expresados como diámetro (mm) de halo de inhibición. 11

21 III. RESULTADOS Figura N 1: Ensayo antimicrobiano del extracto hexánico de Clinopodium taxifolium Chinininga en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Sobre el crecimiento de Sthaphylococcus Aureus. Figura N 2: Ensayo antimicrobiano del extracto hexánico de Clinopodium taxifolium Chinininga en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Sobre el crecimiento de Klebsiella Pneumoniae. 12

22 TABLA N 1: Halos de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae, expresados como diámetro (mm) en placas con extracto hexánico en cantidades de 100 ug, 200 ug, 300 ug y 400 ug. GRÁFICO Nº 1: Promedios de halos de inhibición de crecimiento Sthaphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae, expresados como diámetro (mm) en placas con extracto hexánico en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Diámetro del halo de inhibición (mm) Extractos/placa Vol.microlitro 100 ug Klebsiella Pneumoniae ug ug ug 100ug 200ug 300ug 400ug Hexánico Sthaphylococcus Aureus ug ug ug Ug PROMEDIO INTERPRETACIÓN Actividad Actividad Klebsiella Pneumoniae Staphylococcus Aureus de 13

23 Figura N 3: Ensayo antimicrobiano del extracto etanólico de Clinopodium taxifolium Chinininga en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Sobre el crecimiento de Sthaphylococcus Aureus. Figura N 4: Ensayo antimicrobiano del extracto etanólico de Clinopodium taxifolium Chinininga en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Sobre el crecimiento de Klebsiella Pneumoniae. 14

24 TABLA N 2: Halos de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae, expresados como diámetro (mm) en placas con extracto etanólico en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. GRÁFICO Nº 2: Promedios de halos de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae, expresados como diámetro (mm) en placas con extracto etanólico en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Diámetro del halo de inhibición (mm) Extractos/placa Vol.microlitro 100 ug Klebsiella Pneumoniae ug ug ug Etanólico Sthaphylococcus Aureus ug ug Ug Ug PROMEDIO INTERPRETACIÓN Actividad Actividad Klebsiella Pneumoniae Staphylococcus Aureus 9 100ug 200ug 300ug 400ug 15

25 Figura N 5: Ensayo antimicrobiano del extracto acuoso de Clinopodium taxifolium Chinininga en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Sobre el crecimiento de Sthaphylococcus Aureus. Figura N 6: Ensayo antimicrobiano del extracto acuoso de Clinopodium taxifolium Chinininga en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Sobre el crecimiento de Klebsiella Pneumoniae. 16

26 TABLA N 3: Halos de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae, expresados como diámetro (mm) en placas con extracto acuoso en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Extractos/placa Vol.microlitro 100 ug Klebsiella Pneumoniae ug ug ug Acuoso Staphylococcus Aureus ug ug ug ug PROMEDIO INTERPRETACIÓN Actividad Actividad GRÁFICO Nº 3: Promedios de halos de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus Aureus y Klebsiella Pneumoniae, expresados como diámetro (mm) en placas con extracto etanólico en cantidades de 100 ug, 200ug, 300 ug y 400 ug. Diámetro del halo de inhibición (mm) Klebsiella Pneumoniae Staphylococcus Aureus 0 100ug 200ug 300ug 400ug 17

27 TABLA N 4: Medidas estándares de los halos de inhibición de crecimiento de microorganismos expresados como diámetro (mm) de halo de inhibición en placas con extractos de plantas medicinales. 23 HALOS DE INHIBICIÓN ACTIVIDAD < a 6 mm Negativo 6 a 9 mm Intermedia o Moderada > a 9mm Positivo 18

28 IV. DISCUSIÓN En los países en desarrollo, donde más de un tercio de la población carece de medicamentos esenciales, la administración de remedios tradicionales y alternativos seguros y eficaces podría mejorar de forma importante el acceso a la atención de salud. Por esta razón la finalidad principal de la estrategia de la OMS sobre medicina tradicional publicada en el 2002 es alentar la realización de investigaciones científicas sobre las principales plantas medicinales en los países en desarrollo, para mejorar la salud y el bienestar de la población, reduciendo a la vez al mínimo los riesgos de utilización de remedios de eficacia no demostrada, o de una utilización inadecuada 24. Las propiedades curativas de las plantas se atribuyen a la presencia de un principio activo, el cual produce un efecto fisiológico. Un gran porcentaje de estos principios activos están comprendidos dentro de los productos naturales o metabolitos que son compuestos de estructura compleja y de distribución restringida, entre ellos: alcaloides, esteroides, terpenoides, flavonoides, aceites esenciales, gomas, resinas y taninos, que pueden encontrarse distribuidas por toda la planta o en alguna de sus partes 25. Mediante el presente trabajo se intenta fundamentar el uso artesanal de la planta Clinopodium taxifolium Chinininga mediante los extractos acuoso, hexánico y etanólico; en infecciones respiratorias agudas, para ello se realizó la extracción y posteriormente la determinación de su efecto antibacteriano frente a las cepas de Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae In Vitro, las cuales son agentes causales de IRA y de esta manera contribuir a validar su uso en la medicina tradicional para el tratamiento de estas enfermedades. 19

29 La obtención de los extractos se efectuó con solventes de polaridad creciente, hexánico, etanol y acuoso, los cuales por maceración, calor y filtración se obtuvieron en forma secuencial quienes sirvieron para el enfrentamiento con las cepas en estudio. De este modo el vapor caliente debe llegar hasta los sacos que almacenan los principios activos, su acción térmica permite el hinchamiento de las paredes celulares para facilitar su entrada en el vegetal así como también su fácil abandono de éste, venciendo resistencias difusionales previas y de ésta manera lograr sacar los principios activos al exterior a través de los poros de la pared celular.. Los trabajos dirigidos a evaluar el potencial antibacteriano de extractos algares, mencionan que el proceso de extracción en caliente con etanol ofrece mayores ventajas en la obtención de sustancias bioactivas (Rao y Parekh, 1981; Vlachos et al., 1996; 1997; González et al., 2001) 26. Las ventajas de éste método son su simplicidad, bajo costo y el hecho de poder maniobrar grandes volúmenes de materia prima. La previa trituración del material fresco expone más glándulas y reduce el grueso del material, obteniendo así una extracción más rápida, un mayor rendimiento y mejor calidad del extracto 27. En cuanto al rendimiento obtenido de los extractos fue el siguiente: hexánico 10% (0.01g), etanólico 10 % (0.01 g) y acuoso 10 % (0.01g); con una concentración final de los extractos de 10 mg/ml en cada uno de ellos. Son condiciones determinantes del rendimiento de los extractos: el lugar de procedencia de la muestra, época de recolección, madurez del terreno, edad de la planta, el clima, origen geográfico o pequeños cambios genéticos. Otros factores que influyen son: operaciones previas al proceso de destilación como la adecuada preparación del material, la superficie de contacto y el tiempo de agotamiento de la droga

30 Es notable el hecho de que Clinopodium taxifolium, conocida como Chinininga, no aparece informada como medicinal en los textos de medicina tradicional peruana, a pesar de emplearse frecuentemente su infuso por la población para el tratamiento de las infecciones respiratorias en La Esperanza-Santa Cruz- Cajamarca. Esto puede explicar la ausencia de trabajos anteriores en los que se aborde el estudio fitoquímico de esta planta, ni sobre los componentes de esta especie vegetal en la literatura científica, por lo cual no hay forma de comparar los resultados obtenidos en este trabajo con los de otros autores. Sin embargo si podemos hacerlo comparando la susceptibilidad de los microorganismos con plantas de similar utilización. Los resultados de este trabajo referente a la actividad antimicrobiana en Klebsiella Pneumoniae y Staphylococcus aureus enfrentados con distintas cantidades de 3 extractos trabajados a concentración del 10% expresan resultados positivos comparados con la tabla N 4, así mismo dicha actividad es ascendente respecto a las cantidades utilizadas de cada extracto, las cuales fueron 100ug, 200 ug, 300 ug y 400 ug. (Ver tabla N 1, Nº 2 y Nº 3) Las propiedades antimicrobianas encontradas se explican por las sustancias semi polares y no polares presentes en las hojas de la planta Clinopodium taxifolium. Respecto a los metabolitos secundarios de ésta planta se está realizando un estudio bajo el asesoramiento del Msc. Hugo E. Casanova Herrera, evidenciándose componentes como quinonas, alcaloides, terpenoides, esteroides y otros.(ver anexo N 1) La parte de la planta Clinopodium taxifolium chinininga utilizada fueron las hojas. Vale señalar, que en el órgano hojas existe una gama más completa de principios activos presentes. Esto pudiera estar muy relacionado con el hecho de que es en las hojas donde ocurre, preferiblemente, el proceso de fotosíntesis que tiene lugar en el 21

31 ciclo de vida de las especies vegetales, donde primeramente ocurre la formación de metabolitos primarios, que a su vez constituyen los precursores de los metabolitos secundarios, que son los que se identifican en el tamizaje fitoquímico 28. Los alcaloides pueden estar relacionados con su actividad analgésica, los esteroides pueden ejercer acciones antisépticas, antibacterianas y antifúngicas. Los esteroides se extraen ya sea con etanol, agua o mezclas de etanol-agua y pueden ejercer acciones antibacteriana y fungicida. En un estudio realizado por Vega et al., 2009 obtuvo una gran cantidad de quinonas las que poseen efecto antimicótico y antibacteriano demostrado, lo que explica su éxito en la cura de afecciones cutáneas 29. Con respecto al extracto hexánico se observa en la tabla N 1 y gráfico N 1 halos de inhibición de crecimiento bacteriano correspondiente a Klebsiella Pneumoniae que midieron de 12 mm a 18 mm y para Staphylococcus aureus de 10 mm a 12 mm. En éste resultado observamos que el microorganismo gramnegativo Klebsiella Pneumoniae muestra mayor sensibilidad al extracto hexánico, especialmente a la cantidad de 400ug donde el halo de inhibición es mayor. Según Smith-Palmer existen mejores propiedades antibacterianas con los extractos de numerosas plantas medicinales en bacterias gram positivas, aunque la mayoría de estudios referentes nos demuestran lo contrario, puesto que la mayoría de bacterias a las que hacen referencias como sensibles a extractos hexánico, etanólico u acuoso de plantas antibacterianas resultan ser gram negativas (Shigella, Salmonella typhi, Eschericha coli y, Proteus mirrabillis) a excepción de S. aureus y Bacillus cereus que fueron las únicas bacterias gram positivas presentes en los estudios relacionados. La diferencia de sensibilidad de las bacterias gram positivas y gramnegativas ante diversos extractos depende probablemente de diferencias estructurales en sus paredes celulares 22

32 (es decir, cantidad de peptidoglicanos, presencia de receptores y de lípidos), lo cual determina la penetración, enlace y actividad de los diferentes componentes de los extractos 24. Por otro lado los resultados obtenidos respecto al extracto etanólico, la tabla N 2 y gráfico N 2, muestran halos de inhibición de crecimiento bacteriano de 10 mm a 12 mm para Klebsiella Pneumoniae y de 10mm a 11mm Staphylococcus aureus, donde el microorganismo gramnegativo muestra mayor sensibilidad a la cantidad de 400 ug; sin embargo las diferencias de las cuatro cantidades usadas para el extracto no muestran significativa diferencia para ambos microorganismos. Guerra Ordóñez M. en su estudio sobre Guacamaya francesa. Evaluación de la actividad antimicrobiana in vitro. 1995, obtuvieron respuestas positivas para una gran diversidad de grupos funcionales de compuestos entre los que se destacaron los alcaloides, compuestos reductores, taninos, flavonoides, saponinas, triterpenos, esteroides y quinonas, fundamentalmente en el extracto alcohólico, lo que justifica el por qué el extracto fluido de esta planta se obtiene con menstruo de etanol al 30 % y es el empleado en otros estudios realizados con este arbusto 30,31. En cuanto al extracto acuoso se observaron halos de inhibición de crecimiento bacterianos correspondiente para Klebsiella Pneumoniae que midieron 9mm a 11mm y para Staphylococcus aureus midieron de 10mm a 11mm. Para éste extracto tampoco hubo diferencias notorias para ambos microorganismos, incluso a la cantidad de 400 ug ambos tuvieron la misma medida del halo de inhibición. 23

33 Los extractos de las plantas han demostrado claramente propiedades antibacterianas aunque los mecanismos son pobremente conocidos. Investigaciones sobre los efectos de los principios activos sobre membranas bacterianas aisladas sugieren que su actividad es función de las propiedades lipofílicas de sus constituyentes, la potencia de sus grupos funcionales y su solubilidad en agua. Su sitio de acción aparentemente es la bicapa fosfolipídica causando alteraciones bioquímicas catalizadas por los fosfolípidos de la bicapa de la célula. Estos procesos incluyen la inhibición del transporte de electrones, la translocación de las proteínas, procesos de fosforilación y otras reacciones enzimodependientes. Su actividad en toda la célula parece más compleja 24,32. En nuestro estudio se puede evidenciar que Klebsiella Pneumoniae (Gram negativo) tiene medidas de halos de inhibición mayores que Staphylococcus Aureus (Gram positivo) en los tres extractos, así como también se puede deducir que el efecto antibacteriano posiblemente sea mayor cuando la concentración de los extractos sea mayor de 40 ug. 24

34 V. CONCLUSIONES Después del análisis de los resultados se llegó a las siguientes conclusiones: 1. Se determinó que los extractos hexánico, etanólico y acuoso de la planta Clinopodium taxifolium chinininga tienen actividad antibacteriana in vitro contra Klebsiella Pneumoniae y Staphylococcus aureus. 2. Se determinó que el extracto hexánico mostró mayor halo de inhibición que el extracto acuoso, siendo el tamaño de 12 mm a 18 mm y de 9mm a 11mm respectivamente para Klebsiella Pneumoniae. 3. Se determinó que el extracto hexánico mostró mayor halo de inhibición que el extracto acuoso, siendo el tamaño de 10 mm a 12 mm y de 10 mm a 11mm respectivamente para Staphylococcus aureus. 4. Se determinó que a mayor cantidad de los extractos el efecto antibacteriano será mayor a la concentración de 1% (10mg/ml) siendo Klebsiella Pneumoniae el más sensible. 25

35 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Figueroa N, Estevez T y Jiménez A. Propiedades antibacterianas, antimicóticos e insecticidas de aceites esenciales de especies vegetales aromáticas nativas. Revista Científica BIOFARBO. Colegio de Bioquímica y Farmacia de Bolivia 1995; 4(4): LILACS. 2. Muñoz, M. Efecto del extracto etanólico de hojas de Passiflora foetida granadilla de culebra sobre el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi y Pseudomonas aeruginosa. Tesis para optar el grado de Maestro en Microbiología Clínica. Universidad Nacional de Trujillo, Perú LEE Jong-wook Nuevas directrices de la OMS para fomentar el uso adecuado de las medicinas tradicionales, 22 de Junio de 2004 Ginebra. [en línea] [Con fecha de acceso el 08 de Mayo del 2010]. Web disponible en: Disponible en: 4. Guerra M, Vega R, Rivero R, Menéndez R, Gutiérrez A y Guerra J. Actividad antimicrobiana y toxicidad de un extracto acuoso de Boerhaavia erecta L. Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2004; 9(1):

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42 33

43 1. RESULTADOS ESTUDIO FITOQUIMICO DE Clinopodium taxifolium Chinininga (resultados aun no publicados) F R A C C I Ó N REACCIÓN COLORACIÓN (COL) PRECIPITACIÓN (Pp) ESPECIE VEGETAL Clinopodium taxifolium GELATINA PRECIPITADO Taninos (+) A SHINODA COL: Rojo, azul o Flavonoides (+) verde B LIEBERMANN- COL: verde, azul Esteroides (+) BURCHARD verdoso BORTRÄNGER COL: Rojo Quinonas (+) C BALJET COL: Rojo (clarooscuro) Cardenólidos (+) LEGAL COL: Rojo oscuro Cardenólidos (+) HAGER Pp : picratos Alcaloides (+) cristalinos MAYER Pp : blanco a crema Alcaloides (+) DRAGENDORF Pp : Rojo - naranja Alcaloides (+) F D ROSENHEIN COL: rojo intensorosado Leucoantociani dinas (+) ROSENTHALE R COL: rojo, varias Saponinas Y Triterpenos (+) SHINODA COL: Rojo, azul o Flavonoides (+) E verde ROSENHEIN COL: rojo intensorosado Leucoantociani dinas (+) F ESPUMA Altura:5 mm Saponinas (+) Duración > 15 min MOLISCH Col: anillo violeta Saponinas (+) 34

44 2. PROCESO DE RECOLECCIÓN: Localidad de La Esperanza, Santa Cruz, Cajamarca. Se recolectó 1 Kilogramo de las hojas de la planta Clinopodium taxifolium Chinininga. Se seleccionaron las hojas, eliminando todo elemento extraño. Luego se procedió a triturar la muestra y almacenarlo en recipientes adecuados, libres de humedad y contaminación. 35

45 3. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS: Posteriormente se procedió a la extracción de principios activos de la planta con etanol por 1 hora. Inmediatamente filtramos en caliente, dejamos enfriar. Se llevó a refrigeración por 3 horas para obtener el sarro y el sobrenadante, se separa y se divide en dos partes. El primer recipiente representa el extracto etanólico. El segundo recipiente se llevó a calor hasta obtener un concentrado aproximado de 10 ml. (pastoso) que se dejó enfriar para luego agregar agua destilada (5 ml) al cual agitamos y obtenemos el extracto acuoso. El recipiente que quedó con sarro se agregó 5 ml de hexano, agitamos hasta obtener el extracto 36

46 4. ALMACENAMIENTO DE LOS EXTRACTOS: 1. Extracto hexánico: 2. Extracto Etanólico: 3. Extracto Acuoso: 37

47 5.- ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS: PREPARACIÓN DEL INÓCULO: Se tomó cuatro colonias del cultivo original de cada germen a ensayar con el asa bacteriológica y se suspendió en 5 ml de solución salina fisiológica. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO: En el caso de Sthaphylococcus aureus y Klebsiella Pneumoniae se utilizó como medio de cultivo agar nutritivo DIFCO. SIEMBRA DE LAS PLACAS: Mediante una pipeta estéril, se vertieron 2 ml del inóculo sobre las placas de agar nutritivo sobre la superficie de las placas petri. Se dejó secar de 3 a 5 minutos antes de depositar el extracto de 38

48 APLICACIÓN DEL EXTRACTO: En las placas sembradas, previamente se realizaron 4 pequeños hoyos de 3 mm. de diámetro en donde se verterán 10, 20,30 y 40 µl del extracto de Clinopodium taxifolium Chinininga con sus respectivos extractos. Así mismo se hizo 2 ensayos denominados blanco con hexano y etanol para cada microorganismo. MEDIDA DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN: Transcurridas 24 horas se midió el halo de inhibición de crecimiento de Sthaphylococcus aureus y Klebsiella Pneumoniae y los resultados fueron expresados como diámetro (mm) de halo de inhibición. 39

49 6.- Blancos: Klebsiella pneumoniae 1. Blanco del extracto Hexánico: 2. Blanco del extracto Etanólico: 40

50 Staphylococcus aureus 1. Blanco del extracto Hexánico: 2. Blanco del extracto Etanólico: 41