Catalina Camelo Martínez


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1 EFECTO DE LA SELECCIÓN RIZOSFÉRICA SOBRE LA ACTIVIDAD PROMOTORA DE CRECIMIENTO VEGETAL DE BACTERIAS AERÓBICAS FORMADORAS DE ENDOSPORA PROVENIENTES DEL URABÁ ANTIOQUEÑO Catalina Camelo Martínez Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Posgrado Interfacultades Microbiología Bogotá, Colombia 2014

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3 EFECTO DE LA SELECCIÓN RIZOSFÉRICA SOBRE LA ACTIVIDAD PROMOTORA DE CRECIMIENTO VEGETAL DE BACTERIAS AERÓBICAS FORMADORAS DE ENDOSPORA PROVENIENTES DEL URABÁ ANTIOQUEÑO Catalina Camelo Martínez Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias Microbiología Director: Ph.D. Daniel Uribe Vélez Línea de Investigación: Microbiología ambiental Grupo de Investigación: Microbiología Agrícola Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Posgrado Interfacultades Microbiología Bogotá, Colombia 2014

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5 A mi mamá por ser ejemplo de fortaleza, a mi papá y a mi hermano por su respaldo y cariño, a las chicoritas y a Andrés V. V

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7 VII Agradecimientos A Colciencias por la cofinanciación del proyecto Evaluación del efecto de tipo de suelo y efecto rizósfera sobre la especiación y actividad promotora de crecimiento vegetal en bacterias aerobias formadoras de Endospora, dentro del cual se encuentra enmarcado mi trabajo. A la Universidad Nacional de Colombia por ser mi segundo hogar desde el año 2005 y al posgrado interfacultades de Microbiología por brindarme las herramientas para forjar mi maestría. Al profesor Daniel Uribe Vélez por su confianza, apoyo y enseñanzas, a mis compañeros de laboratorio por su colaboración constante a pesar de sus propias ocupaciones, a Diana Gantiva y Luis Fernando Gómez por su entrega y dedicación. A Andrés Castillo, Germán, Yolanda y Socorrito por su apoyo, por sentir mi trabajo como propio.

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9 IX Resumen La distribución y actividad de las Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR, por su sigla en inglés) han sido poco estudiadas desde una perspectiva ecológica, por tanto no se conoce la influencia que el hábitat puede ejercer sobre dichas propiedades. En ese contexto, en el presente estudio se evaluó si los principales factores que definen el hábitat de las rizobacterias (planta y suelo) pueden ser determinantes en la selección de diferentes grupos funcionales de Bacterias Aeróbicas Formadoras de Endospora (BAFE) con la capacidad para promover el crecimiento vegetal. Con este fin, se caracterizaron 148 cepas de BAFE provenientes de hábitats contrastantes en términos de planta y de fertilidad del suelo, contraste logrado al encontrar un gradiente natural de ph en suelos del Urabá antioqueño, sobre el cual se tenían plantas de iraca (Carludovica palmata) y de maíz (Zea mays). La caracterización realizada comprendió la producción de compuestos indólicos y de ACC deaminasa, la capacidad de solubilizar fosfatos, la actividad antagónica contra diferentes agentes fitopatogenos, y la promoción de crecimiento de plantas de maíz, actividades relacionadas con la promoción de crecimiento vegetal. La evaluación mostró que la rizósfera de maíz seleccionó las cepas con mayor producción de compuestos indólicos, que el hábitat iraca-fertilidad baja favoreció la presencia de cepas antagónicas y que la promoción del crecimiento del vástago, en las pruebas in vivo, se asoció con las cepas provenientes del hábitat maíz-fertilidad alta; la capacidad solubilizadora de fosfato, por el contrario, no mostró asociación con las condiciones de origen de las cepas. Al analizar la caracterización en conjunto se observó que la planta fue el factor determinante del hábitat que mayor asociación tuvo con la diferenciación funcional de las cepas. En conclusión, existen variables del hábitat que seleccionan los mecanismos asociadas a la promoción de crecimiento vegetal, variables que al ser entendidas permitirían direccionar mejor los procesos de bioprospección. Palabras clave: Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR), Bacterias Aeróbicas Formadoras de Endospora (BAFE), Rizósfera, Hábitat, Bioprospección.

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11 XI Abstract Distribution and activity of Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) have been scarcely studied from an ecological basis, therefore the effect of habitat on these properties is not known. In that context, the aim of this work was to evaluate whether the principal factors that define rhizobacteria habitat (plant and soil) may be decisive in the selection of different functional groups of Aerobic Endospore-Forming Bacteria (AEFB) with the ability to promote plant growth. For this purpose, 148 AEFB strains from contrasting habitats (in terms of plant and soil fertility) were characterized, contrast achieved by finding a natural soil ph gradient in the Urabá antioqueño region where iraca (Carludovica palmata) and maize (Zea mays) plants were found. The characterization of the isolates included phosphate solubilization, indolic compound and ACC deaminase production, antagonistic activity against phytopathological agents, and in vivo promotion of maize plants, abilities associated to plant growth promotion activity. We found that the maize rhizosphere selected strains with the highest production of indole compounds, the iraca-low fertility habitat favored the presence of antagonistic strains, the stem promoting growth ability was associated with the maize-high fertility habitat and the phosphate solubilizing capacity was not associated with the conditions of origin of the strains. The overall characterization showed that the plant was the habitat factor that had greater association with functional differentiation of strains. In conclusion, there are habitat variables that select mechanisms associated with the plant growth promoting activity, which may be used to improve the bioprospecting processes. Keywords: Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR), Aerobic Endospore- Forming Bacteria (AEFB), Rhizosphere, Niche, Bioprospecting.

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13 XIII Contenido Pág. Resumen...IX Lista de figuras... XV Lista de tablas... XIX Introducción Marco teórico Rizósfera Factores que determinan la rizósfera Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR, por la sigla en inglés) Efecto de la rizósfera sobre las PGPR Mecanismos de acción de las PGPR Bacterias aeróbicas formadoras de endospora (BAFE) Bioprospección en PGPR Problema de investigación y objetivos Problema de investigación Planteamiento Justificación Preguntas de investigación Hipótesis Objetivos Objetivo general Objetivos específicos Muestreo y aislamiento de BAFE Zona de muestreo Muestreo Aislamiento selectivo de BAFE Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE Metodología Preparación de Inóculo Solubilización de fosfatos Producción de compuestos indólicos Producción de ACC deaminasa Capacidad antagónica contra diferentes agentes fitopatógenos... 25

14 XIV Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño 4.2 Resultados Solubilización de Fosfato Producción de compuestos indólicos Producción de ACC deaminasa Capacidad antagónica contra diferentes agentes fitopatógenos Discusión Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz Metodología Preparación de la suspensión de endosporas Germinación de las semillas de maíz Inoculación de las semillas Prueba en invernadero Longitud y peso seco de las plantas Repetición en el tiempo Análisis estadístico Resultados Repetición en el tiempo Relación entre la promoción de crecimiento en planta y los rasgos bioquímicos y biológicos Discusión Relaciones entre las características del origen de los aislados de BAFE y su capacidad promotora de crecimiento vegetal Metodología y resultados Relación de los rasgos bioquímicos y biológicos analizados in vitro con las características de origen de las BAFE Relación entre la promoción de crecimiento en planta y las características de origen de las BAFE Relación entre los rasgos bioquímicos, la promoción de crecimiento y las características de origen de las BAFE Discusión Conclusiones y recomendaciones Conclusiones Recomendaciones A. Anexo: Curva de calibración para la medición de fosfato soluble B. Anexo: Curva de calibración para la medición de compuestos indólicos C. Anexo: Cepas que promovieron crecimiento vegetal según la prueba LSD.. 75 Bibliografía... 79

15 XV Lista de figuras Pág. Figura 3-1: Mapa de la zona de muestreo ubicando los ocho puntos donde se tomaron muestras. Se puede observar la ubicación de la zona a nivel departamental y nacional. 16 Figura 3-2: Análisis de componentes principales para las características fisicoquímicas de los suelos de los ocho puntos de muestreo. El componente 1 explica el 44.9% de la variación y el componente 2 el 23.8% Figura 4-1: Evaluación de la producción de ACC deaminasa, se resalta en el ovalo azul el resultado positivo como productora de ACC deaminasa de la cepa 208 de Pseudomonas sp (control positivo de la prueba). Los medios empleados fueron SMM con ACC como única fuente de nitrógeno (SMM+ACC), medio SMM con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno (SMM+N), y medio SMM sin fuente de nitrógeno (SMM.) Figura 4-2: Categoría de inhibición de los hongos fitopatógenos obtenidos en la prueba de antagonismo. A. Cepa positiva, producción de halo de inhibición del crecimiento del hongo. B. Cepa limitante, el crecimiento del hongo no sobrepasa la estría donde creció la bacteria, caso observado al lado izquierdo de la foto. C. Cepa negativa, el crecimiento del hongo no se detiene y pasa por encima de las bacterias Figura 4-3: Área de inhibición de crecimiento del hongo producida por la BAFE. Se señala con amarillo el área que fue medida y registrada para cada cepa con resultado positivo Figura 4-4: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada uno de las tres categorías en mg/l establecidas para la capacidad solubilizadora de Fosfato de Calcio. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.).. 27 Figura 4-5: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada uno de las tres categorías en mg/l establecidas para la capacidad solubilizadora de Fosfato de Hierro. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.).. 28 Figura 4-6: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada uno de las tres categorías en mg/l establecidas para la capacidad solubilizadora de Fosfato de Aluminio. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.).. 29

16 XVI Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Figura 4-7: Relación de la capacidad solubilizadora de fosfato combinando por pares las tres fuentes empleadas. (A.) Fosfato de calcio y de hierro, (B.) Fosfato de calcio y de aluminio y (C) Fosfato de hierro y aluminio. Los símbolos representan los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de alta ( ) y baja fertilidad ( ) y las cepas provenientes de la rizósfera de maíz con suelos de alta ( ) y baja fertilidad ( ) Figura 4-8: Porcentaje de las cepas pertenecientes a cada una de las tres categorías establecidas en µg/ml para la producción de compuestos indólicos. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.) Figura 4-9: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada una de las tres categorías de inhibición establecidas, prueba contra Rhizoctonia solani. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.) Figura 4-10: Área de inhibición del crecimiento micelial de Rhizoctonia solani producida por cepas provenientes de la rizósfera de de iraca (Carludovica palmata) (A.) y de maíz (Zea mays) (B.), diferenciando el nivel de fertilidad del suelo de donde provienen. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. Los asteriscos (*) señalan las medidas estadísticamente similares al control con un nivel de significancia del Figura 4-11: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada una de las tres categorías de inhibición establecidas, prueba contra Botrytis cinerea. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.) Figura 4-12: Área de inhibición del crecimiento micelial de Botrytis cinerea producida por cepas provenientes de la rizósfera de de iraca (Carludovica palmata) (A.) y de maíz (Zea mays) (B.), diferenciando el nivel de fertilidad del suelo de donde provienen. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. Un asterisco (*) señala las medidas estadísticamente similares, dos asteriscos (**) la medida superior al control, ambos con un nivel de significancia del Figura 4-13: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada una de las tres categorías de inhibición establecidas, prueba contra Fusarium oxysporum. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.) Figura 4-14: Área de inhibición del crecimiento micelial de Fusarium oxysporum producida por cepas provenientes de la rizósfera de de iraca (Carludovica palmata) (A.) y de maíz (Zea mays) (B.), diferenciando el nivel de fertilidad del suelo de donde provienen. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. Los asteriscos (*) señalan las medidas estadísticamente similares al control con un nivel de significancia del Figura 5-1: Caja de Petri con las cuatro últimas diluciones seriadas 1:10 realizadas por cepa Figura 5-2: Diferentes fases de la prueba de invernadero. A. Cámara húmeda donde las semillas ya desinfectadas se colocaban a germinar. B. Proceso de siembra de las

17 XVII semillas germinadas, se puede observar el sustrato de arena-gravilla 1:1 empleado. C. Plantas extraídas y lavadas luego de un mes de crecimiento en el invernadero. D. Plantas de maíz una semana después de haber sido sembradas. E. Las instalaciones del invernadero con plantas de un mes de crecidas Figura 5-3: Porcentaje de las cepas que promovieron el crecimiento vegetal temprano de las plantas de maíz, medido a través de la longitud (A.) y el peso seco del vástago (B.), así como la longitud (C.) y el peso seco de la raíz (D.). Las cepas se clasificaron según sus características de planta y suelo de origen Ifa (Iraca-Fertilidad alta), Ifb (Iraca- Fertilidad baja), Mfa (Maíz-Fertilidad alta), Mfb (Maíz-Fertilidad baja) Figura 5-4: Porcentaje de cepas que pertenecen a cada una de las categorías de actividad antagónica contra los tres hongos fitopatógenos. Cepas que presentaron promoción de una o dos variables asociadas a promoción de crecimiento en planta (A.) y cepas que no presentaron promoción de ninguna variables asociada a promoción de crecimiento en planta (B.) Figura 6-1: Porcentaje de las cepas que presentaron actividad antagónica contra los tres hongos fitopatógenos. Las cepas se clasificaron según sus características de planta y suelo de origen Ifa (Iraca-Fertilidad alta), Ifb (Iraca-Fertilidad baja), Mfa (Maíz-Fertilidad alta), Mfb (Maíz-Fertilidad baja) Figura 6-2: Análisis de componentes principales para las variables medidas en planta asociadas a la capacidad de las cepas de promover el crecimiento vegetal. Las cepas se clasificaron según sus características de planta y suelo de origen Ifa (Iraca-Fertilidad alta), Ifb (Iraca-Fertilidad baja), Mfa (Maíz-Fertilidad alta), Mfb (Maíz-Fertilidad baja). El componente 1 explica el 60.8% de la variación y el componente 2 el 18% Figura 6-3: Análisis discriminante para los rasgos bioquímicos, las variables de promoción y las características del hábitat de origen de las BAFE. Ifa (Iraca-Fertilidad alta), Ifb (Iraca-Fertilidad baja), Mfa (Maíz-Fertilidad alta), Mfb (Maíz-Fertilidad baja)

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19 XIX Lista de tablas Pág. Tabla 3-1: Análisis fisicoquímico de los ocho puntos de muestreo Tabla 3-2: Número de morfotipos obtenidos para los ocho puntos de muestreo, diferenciando además por planta Tabla 5-1: Rasgos bioquímicos y biológicos de las cepas que fueron inferiores estadísticamente al control Tabla 5-2: Promoción de crecimiento de las cepas que se destacaron estadísticamente según la prueba de Tukey. Cada cepa presenta el promedio y la desviación estándar de la variable donde promovió Tabla 5-3: Rasgos bioquímicos y biológicos de las cepas que fueron escogidas para la repetición en el tiempo Tabla 5-4: Promoción de crecimiento de las cepas que se repitieron en el tiempo. Los asteriscos (*) señalan las medidas estadísticamente superiores al control con p-valor < Tabla 5-5: Estadístico y p-valor en paréntesis de la prueba no paramétrica de correlación de Spearman (ρ) entre los rasgos bioquímicos y las variables asociadas a promoción de crecimiento en planta. Los asteriscos (*) señalan las correlaciones estadísticamente significativas con p-valor < Tabla 6-1: Resultado de la prueba de independencia entre los rasgos bioquímicos y biológicos y el hábitat de origen de los aislados Tabla 6-2: Resultado de la prueba de independencia entre las variables de la planta asociadas a promoción de crecimiento y el hábitat de origen de los aislados

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21 Introducción En la actualidad los fertilizantes utilizados en la agricultura representan un inconveniente para la competitividad de los sistemas de producción y para el medio ambiente. En los sistemas de producción agrícola las tendencias alcistas en los precios de los fertilizantes hacen que los costos de producción sean elevados y fluctuantes, lo que atenta contra la rentabilidad de dicho sector, sumado a esta problemática, los fertilizantes una vez aplicados tienen una baja eficiencia, es decir que un alto porcentaje no es absorbido por la planta, sino que se pierde por erosión, lixiviación o acomplejamiento, lo que no sólo es un problema de costos, sino también un problema medioambiental. Las Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR, por su sigla en inglés) son microorganismos que tienen una interacción positiva con las plantas, interacción que se refleja en el aumento en el crecimiento de la misma y en una mayor resistencia ante fitopatógenos o condiciones de estrés medioambientales. Los mecanismos de las PGPR han sido estudiados con el fin de dar respuesta al reto de promover la producción rentable y ambientalmente sostenible de los sistemas de producción agrícola. Dentro de las PGPR se encuentra el grupo de las Bacteria Aeróbicas Formadoras de Endóspora (BAFE), un grupo que además de tener variedad de mecanismos promotores de crecimiento vegetal, se caracteriza por la formación de una estructura de resistencia (la endospora), que permite una mayor permanencia en el medio ambiente, mejorando así la viabilidad de los bioinsumos desarrollados a partir de dichos microorganismos. La investigación que rodea a las PGPR se ha centrado en identificar y describir los mecanismos de promoción de crecimiento vegetal desde un enfoque bioquímico y genético, lo que ha permitido generar técnicas de detección y cuantificación de las actividades, pero se tienen muy pocos estudios que profundicen en los aspectos ecológicos que determinan la distribución de estos microorganismos en la naturaleza. Por ejemplo, no se conoce qué influencia podría tener el hábitat (la rizósfera) en la presencia de microorganismos con actividades de promoción de crecimiento vegetal, ni si rizósferas contrastantes podrían seleccionar cepas con mecanismos de promoción diferentes, a pesar de que dicho conocimiento optimizaría los procesos de búsqueda de microorganismos promisorios. La influencia del hábitat en las rizobacterias ha sido estudiada desde los dos factores que la determinan: el suelo y la planta, con un único enfoque que es las propiedades estructurales de la comunidad. Los resultados obtenidos muestran que en algunos casos uno de los dos factores (el suelo o la planta) determina en mayor medida a la comunidad microbiana, y en otros que es la interacción de ambos factores; es decir que la influencia

22 2 Introducción del hábitat a nivel de la estructura de la comunidad ha sido ampliamente observada, pero a nivel funcional aún no se tiene clara. En ese contexto, el presente trabajo buscó evaluar el efecto del hábitat sobre propiedades funcionales del grupo de BAFE, particularmente si el hábitat ejerce un efecto de selección sobre los mecanismos asociados a la actividad promotora de crecimiento vegetal. Un objetivo que pudo construirse dado el establecimiento de cuatro tipos de hábitats o rizósferas contrastantes en términos de nivel de fertilidad de los suelos y de planta sembrada en los suelos de la región del Urabá antioqueño. Es importante resaltar que las rizósferas contrastantes se establecieron a partir de la identificación de un gradiente natural de ph en los suelos de la región del Urabá antioqueño, un gradiente que al dar variaciones en las características fisicoquímicas de los suelos y por ende diferencias a nivel de disposición de nutrientes, permitió definir estadísticamente dos grupos de suelos contrastantes en términos de fertilidad (fertilidad alta y fertilidad baja). El beneficio del gradiente natural es que los dos grupos son diferentes a nivel de fertilidad, pero al pertenecer a la misma matriz comparten origen e historia de uso, lo que limita la intervención de otras fuentes de variación. El contraste en términos de la planta se dio al encontrar distribuida por todo el gradiente a la especie vegetal Carludovica palmata (iraca), y al sembrar en esos mismos suelos a la especie cultivable Zea mays L. (maíz). Como resultado las cuatro hábitats se denominaron: iracafertilidad alta, iraca-fertilidad baja, maíz-fertilidad alta, y maíz-fertilidad baja. La forma en la que se establecieron los contrastes en las rizósferas de origen, según la revisión bibliográfica realizada, no han sido abordados hasta el momento por otros investigadores, lo que resalta la importancia del presente estudio como una aproximación muy interesante al conocimiento de los fundamentos ecológicos que están asociados a la presencia de PGPR y en particular a los mecanismos que éstas realizan. El conocimiento generado es relevante para la implementación de procesos de bioprospección que argumenten sus métodos de búsqueda con parámetros ecológicos. Este direccionamiento contribuiría a la eficacia de dichos procesos y por ende a la materialización de productos biológicos que mejoren la sostenibilidad y salubridad de los sistemas agrícolas de producción. Un tema que en Colombia tiene gran importancia dada la alta diversidad biológica y el potencial agrícola que caracteriza al país.

23 1. Marco teórico 1.1 Rizósfera El concepto de rizósfera fue abordado inicialmente por Hiltner (1904) quien observó en sus estudios que existía un volumen de suelo que era alterado por las raíces de las plantas, un espacio que era compartido por ciertas poblaciones de microorganismos. Las conclusiones acertadas de Hiltner derivaron en múltiples estudios que desarrollaron y complementaron el término (Gregory, 2006). La rizósfera se definió entonces como el volumen de suelo que rodea a la raíz de la planta y que se encuentra bajo la influencia de la misma (Kennedy, 2005), conformando un hábitat particular, caracterizado por el alto flujo energético que se da como consecuencia del elevado porcentaje, entre el 20 y el 50%, de fotosintatos que la planta libera por sus raíces (Buchenauer, 1998) Factores que determinan la rizósfera La rizósfera está determinada principalmente por dos factores: la planta, a través de los exudados que se liberan por la raíz, y el suelo, por sus características fisicoquímicas. La planta La liberación o exudación de los fotosintatos por la raíz, denominada rizodeposición (Gregory, 2006), es la responsable de cambios físicos, químicos y biológicos en el suelo circundante a la raíz, es decir en la rizósfera, alteraciones que se conocen con el término de efecto rizosférico (Badalucco & Kuikman, 2001). El efecto rizosférico generado tiene implicaciones en la porosidad del suelo, en este sentido Bruand, Cousin, Nicoullaud, Duval, and Begon (1996) encontraron que la porosidad era del 22 al 24% mayor en la rizósfera de maíz que en el suelo aledaño; en cambios localizados del ph, con el fin de facilitar la solubilización de ciertos nutrientes como el fósforo (Khan, Jilani, Akhtar, Naqvi, & Rasheed, 2009); en alteraciones de la abundancia y composición de la comunidad microbiana (Lynch, 1990) y en procesos de formación del suelo (Gregory, 2006).

24 4 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Efecto de la planta sobre la comunidad microbiana rizosférica Los exudados de la raíz son principalmente azúcares, polisacáridos, ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas (Jones, Hodge, & Kuzyakov, 2004) y sustancias que intervienen en la comunicación de la planta con su entorno biótico (Walker, Bais, Grotewold, & Vivanco, 2003). El tipo y la cantidad de sustancias que son exudadas dependen de la planta (Kamilova et al., 2006), es así que diferentes especies vegetales sembradas en un mismo tipo de suelo pueden generar alteraciones biológicas diferenciales, es decir, seleccionar diferentes poblaciones de microorganismos. Lemanceau et al. (1995) reportan para plantas de tomate (Lycopersicon esculentum) y de lino (Linum usitatissinum) que las plantas de lino fueron más selectivas para la población de pseudomonados fluorescentes; por otro lado, Smalla et al. (2001) encontraron para plantas de fresa (Fragaria ananassa), canola (Brassica napus) y papa (Solanum tuberosum) que la distribución de la abundancia relativa de la población bacteriana, analizada a través de una electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) fue particular para cada una, mostrando además, para las tres plantas, que la edad del cultivo también influye en la composición de la comunidad bacteriana. En cultivos de papa (Solanum tuberosum L.) se reportó que el estado de desarrollo de la planta tiene el efecto principal sobre la comunidad microbiana, seguido por el tipo de variedad (Van Overbeek & Van Elsas, 2008). Relación que es propia de la producción diferencial de exudados en las etapas de crecimiento y desarrollo de las plantas (Dey, Pal, & Tilak, 2012). Un estudio realizado con dos especies vegetales (Cynoglossum officinale, Cirsium vulgare) sembradas en el mismo suelo mostró que la comunidad rizosférica era particular a cada planta, pero que la comunidad del suelo circundante era similar entre parcelas, lo que los llevó a sugerir que la selección de la comunidad rizosférica era efecto de la planta, y la comunidad del suelo no rizósferico era determinada por las características físico químicas de la zona (Kowalchuk, Buma, de Boer, Klinkhamer, & van Veen, 2002). El Suelo El suelo al ser una matriz derivada de la meteorización del material parental es un hábitat heterogéneo y dinámico, que depende de condiciones climáticas y geográficas para su continua transformación, como el material parental y las condiciones de meteorización son variadas se generan así mismo gran variedad de suelos (Hartel, 2005). Una forma de describir o caracterizar un suelo en particular es a través de sus propiedades físicas y químicas, dentro de estas propiedades encontramos ph, humedad, disponibilidad de agua, porosidad, textura, salinidad, contenido de materia orgánica, capacidad redox, entre otras (Hani Antoun & Prévost, 2006). El ph del suelo es una característica que está asociada a otras, lo que lo convierte en un indicador general del tipo y estado del mismo. Algunas de las características ligadas al ph según Jaramillo (2002) son: La disponibilidad de nutrientes, dados los rangos diferenciales de ph a los que los elementos o compuestos están en su máxima disponibilidad.

25 Marco Teórico 5 La capacidad de intercambio iónico del suelo, puesto que del ph depende la carga variable del suelo, es decir si es un intercambiador catiónico o aniónico. El régimen de precipitación, dado que el exceso o la deficiencia de lluvias generan la lixiviación o la acumulación de bases, según sea el caso. La historia de uso, puesto que las prácticas agrícolas pueden tener efectos residuales ácidos o básicos. Las características asociadas al ph son en gran medida las propiedades que describen el nivel de disponibilidad de nutrientes o de fertilidad de un suelo (cantidad de materia orgánica, capacidad de intercambio iónico y la forma química en la que se presentan los elementos). La fertilidad del suelo permite la sostenibilidad tanto del crecimiento vegetal como el de los microorganismos edáficos por tanto va a influir en su distribución. Efecto del suelo sobre la comunidad microbiana rizosférica Investigaciones relacionadas sobre la influencia que el tipo de suelo ejerce sobre la comunidad microbiana de la rizósfera han mostrado como la comunidad bacteriana es alterada estructuralmente por el tipo de suelo, más que por el tipo de manejo agrícola de esos suelos (Girvan, Bullimore, Pretty, Osborn, & Ball, 2003; Suzuki, Nagaoka, Shimada, & Takenaka, 2009). Por ejemplo, Buckley and Schmidt (2001) encontraron que la comunidad microbiana variaba entre zonas cercanas que se diferenciaban por tener o no una historia de uso de aproximadamente 50 años, dentro de la zona con historia de uso la comunidad microbiana no cambió a pesar de tener subzonas con manejos y cultivos diferentes, lo que sugeriría un efecto sobre la comunidad microbiana que está influenciado inicialmente por el tipo de suelo y en segunda medida por el periodo de uso. El ph también ha sido determinado como modulador de la estructura y composición de las comunidades microbianas del suelo. Es así como se han reportado variaciones en la biomasa microbiana (Bååth & Anderson, 2003), y en la composición, abundancia y diversidad de la comunidad bacteriana, acorde a un gradiente de ph definido en una misma zona (Rousk et al., 2010) y a escala continental (Fierer & Jackson, 2006; Lauber, Hamady, Knight, & Fierer, 2009), encontrando para estos últimos estudios una correlación lineal significativa entre el ph del suelo y la diversidad microbiana. Efecto de la interacción planta suelo sobre la comunidad microbiana rizosférica Trabajos que al igual que el presente estudio han evaluado en conjunto la influencia del suelo y de la planta sobre grupos de microorganimos específicos, han encontrado que el suelo es el factor más influyente. Dalmastri, Chiarini, Cantale, Bevivino, and Tabacchioni (1999), empleando la técnica de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), encontraron que la diversidad genética de la población de Burkholderia cepacia asociada al sistema radicular de maíz (Zea mays) depende más del tipo de suelo que de la variedad de maíz. Resultado similar al reportado para la población de pseudomonados fluorescentes evaluada en suelos cultivados y no cultivados, donde el tipo de suelo tuvo

26 6 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño una mayor selección que la planta (Latour, Corberand, Laguerre, Allard, & Lemanceau, 1996). Por otro lado, investigaciones realizadas sobre la comunidad microbiana evaluando también la influencia conjunta del suelo y de la planta, han reportado para algunos casos que la planta es el factor más influyente y en otros casos que es una interacción de ambos factores. Miethling, Wieland, Backhaus, and Tebbe (2000) reportaron que la diversidad, la composición y la abundancia de la comunidad estaba más influenciada por los dos tipos de planta que evaluaron (Medicago sativa y Secale cereale) que por el suelo, concluyendo que los exudados eran el factor que seleccionaba a los microorganismos por encima de la historia de uso diferencial de los suelos muestreados. Conclusión similar a la que llegaron Grayston, Wang, Campbell, and Edwards (1998), al evaluar cuatro especies de plantas y dos tipos de suelo y encontrar, a través del Biolog system que los perfiles de las fuentes de carbono empleadas por la comunidad microbiana se diferenciaban por la planta y no por tipo de suelo, lo que se relacionaba además con las poblaciones de microorganismos que aislaron de las muestras. En el trabajo de Marschner, Yang, Lieberei, and Crowley (2001) se evaluaron tres plantas (garbanzo, canola y sorgo), tres tipos de suelo (arenoso, franco arenoso y arcilloso) y dos zonas de la raíz (zona de formación de raíces laterales y zona apical), obteniendo resultados que no les permitieron definir un solo factor con mayor influencia, puesto que para cada planta y tipo de suelo el factor determinante de la estructura de la comunidad bacteriana era diferente, mostrando la compleja interacción de dichos factores. Otro trabajo en el que se demuestra la interacción de la planta y el tipo de suelo, es el desarrollado por Velasco, Probanza, Mañero, Solano, and Lucas (2010), en esta investigación se utilizaron tres variedades de Arabidopsis thaliana modificadas genéticamente y tres suelos ácidos provenientes de zonas diferentes, obteniendo que la estructura de la comunidad, estudiada a través de un análisis de fosfolípidos (PLFA), se modificaba por el genotipo de la planta, pero que este efecto variaba también por el tipo de suelo. 1.2 Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (PGPR, por la sigla en inglés) Las bacterias capaces de colonizar las raíces de las plantas, conocidas como rizobacterias (H. Antoun & Kloepper, 2001), han desarrollado a través de la coevolución interacciones con la planta hospedero que se manifiestan en el crecimiento vegetal. Aquellas bacterias con interacciones positivas son denominadas Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR, por la sigla en inglés), término que fue abordado inicialmente por J. Kloepper and Schroth (1981). Las interacciones positivas de las PGPR se relacionan con incrementos en parámetros vegetales tales como tasa de germinación, crecimiento aéreo y radicular, producción, área foliar, contenido de clorofila y concentración de nutrientes, así como retraso en la senescencia y aumento en la tolerancia a sequía y otros factores de estrés (Lucy, Reed, & Glick, 2004).

27 Marco Teórico Efecto de la rizósfera sobre las PGPR Las PGPR al ser parte de la comunidad microbiana rizosférica tienen determinado su hábitat precisamente por la rizósfera, la cual está definida por el tipo de suelo y de planta, tal como se describió anteriormente. El efecto del hábitat sobre la actividad de las PGPR no se conoce. No obstante, estudios adelantados por el profesor Cohan han mostrado, especialmente para el género Bacillus, que el nicho influye sobre la evolución y especiación bacteriana (Cohan, 2002, 2011), lo que podría sugerir, tal como lo dice C. A. Ramírez, que la capacidad para promover el crecimiento vegetal es una respuesta a las exigencias del nicho a partir del cual han evolucionado (comunicación personal, 16 de enero, 2012) Mecanismos de acción de las PGPR Los mecanismos de acción de las PGPR las han dividido en tres categorías: biofertilizantes, fitoestimulantes y bioplaguicidas (Bhattacharyya & Jha, 2012). Las PGPR con función de biofertilizante aumentan la disponibilidad de nutrientes para la planta, las de acción fitoestimuladora producen una o varias sustancias reguladoras del crecimiento vegetal (Vessey, 2003) y las de actividad bioplaguicida controlan a agentes fitopatógenos a través de la producción de antibióticos, la síntesis de enzimas extracelulares que hidrolizan la pared fúngica, la eficiente colonización de nichos en la rizósfera (Banerjee, Yesmin, & Vessey, 2006) y la inducción de resistencia en el hospedero (Van Loon, Bakker, & Pieterse, 1998). Biofertilizantes El aumento en la disponibilidad de nutrientes se da principalmente por la capacidad de las PGPR de solubilizar fosfatos, fijar nitrógeno y facilitar la absorción de hierro (Vessey, 2003). La solubilización de fosfatos es una capacidad importante si se tiene en cuenta que el fósforo es un macronutriente que se encuentra principalmente de forma insoluble en el suelo, lo que reduce su disponibilidad para las plantas (Stevenson & Cole, 1999), hecho que es un limitante en el crecimiento y desarrollo de las mismas, puesto que el fósforo participa en varios procesos metabólicos esenciales como lo son: la fotosíntesis, la transferencia de energía y la síntesis de macromoléculas (S. B. Sharma, Sayyed, Trivedi, & Gobi, 2013). La forma insoluble depende del tipo de suelo, presentándose complejos de fosfatos de calcio en suelos básicos y de fosfatos de hierro y aluminio en suelos ácidos (Khan et al., 2009). El fósforo inorgánico es solubilizado principalmente por la producción de ácidos orgánicos, estos compuestos actúan acidificando el suelo circundante o quelando los cationes de calcio, hierro y aluminio que pueden atrapar al ion fosfato (Richardson, Barea, McNeill, & Prigent-Combaret, 2009). Otros mecanismos reportados para la solubilización del fósforo inorgánico son la producción de ácidos inorgánicos, como el ácido nítrico, el sulfúrico y el sulfhídrico; y el bombeo de protones H+. Para el caso de la mineralización de fósforo en complejos orgánicos se ha reportado la producción de enzimas, especialmente fosfatasas ácidas, alcalinas y fitasas. Adicionalmente, los microorganismos evitan que el fósforo sea

28 8 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño acomplejado al inmovilizarlo en sus moléculas, lo que facilita su disposición cuando las células microbianas mueren (S. B. Sharma et al., 2013). La actividad solubilizadora es común dentro del género Bacillus (A. Kumar, Prakash, & Johri, 2011), se tienen trabajos que reportan dicha capacidad en Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus atrophaeus y Paenibacillus macerans, identificando como mecanismo de acción la producción de ácidos orgánicos como el láctico, el isobutírico, el isovalérico y el acético (Vazquez, Holguin, Puente, Lopez-Cortes, & Bashan, 2000). Por otra parte en el género Bacillus también han sido reportados resultados en la promoción de crecimiento vegetal en función de la promoción de la germinación y el crecimiento temprano en Cicer arietinum por la inoculación de Bacillus megaterium (K. Sharma, Dak, Agrawal, Bhatnagar, & Sharma, 2007). Fitoestimulantes La producción de sustancias reguladoras de crecimiento vegetal producidas en las dosis adecuadas propician el aumento en el crecimiento de la planta. La estimulación al crecimiento, particularmente el de la raíz, permite que la planta tenga una mayor área de absorción de nutrientes, hecho que ha llevado a postular a las PGPR fitoestimuladoras como parte de las biofertilizantes (Vessey, 2003). Las sustancias reguladoras de crecimiento vegetal que han sido ampliamente asociadas a PGPR son auxinas, citoquininas y ácido giberélico (Banerjee et al., 2006). El ácido indol acético (AIA) es la principal auxina, esta hormona está implicada en la división y elongación de las células de la raíz de las plantas, incluyendo la formación de los pelos radiculares, así como en el proceso de enraizamiento y generación de brotes (Taiz & Zeiger, 2006). Se conocen seis rutas de síntesis del AIA, de las cuales cinco tienen como precursor inicial al triptófano. La ruta del indol-3-piruvato, conocida como IPyA, es la que más se asocia con las PGPR, no obstante se sabe que un mismo microorganismo puede tener varias rutas de síntesis, es decir que junto con la IPyA puede tener la ruta del indol-3-acetamida (Williamson, Tudzynski, Tudzynski, & van Kan), relacionada con microorganismos patógenos, o la ruta de la triptamina que ha sido reportada para Bacillus cereus (Spaepen, Vanderleyden, & Remans, 2007). Los efectos de la inoculación de PGPR productores de AIA en plantas son principalmente: promoción en el enraizamiento, en la longitud de las raíces y en la cantidad de brotes, tal como se reporta para Dioscorea rotundata tratada con Bacillus subtilis (Swain, Naskar, & Ray, 2007) y para estacas de kiwi (Actinidia deliciosa) inoculadas con varias cepas del género Bacillus (Erturk, Ercisli, Haznedar, & Cakmakci, 2010). La producción de la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC.) deaminasa está relacionada con la fitoestimulación, puesto que el ACC es un precursor del etileno, fitohormona encargada de modular la respuesta de la planta ante condiciones de estrés (la inhibición del crecimiento), la producción de la enzima permite la hidrólisis del ACC y por ende la disminución de la concentración de etileno (Glick, Cheng, Czarny, & Duan, 2007), disminución que permite que la planta sea más resistente y por ende tenga un mayor crecimiento a pesar de factores estresantes como inundación (Grichko & Glick, 2001) o salinidad (Mayak, Tirosh, & Glick, 2004).

29 Marco Teórico 9 Es importante mencionar que el AIA y el ACC pueden interactuar, se sabe que la producción excesiva de AIA estimula la producción de la enzima ACC sintasa y por consiguiente la producción de ACC y de etileno, lo que se traduce como una señal de estrés para la planta llevando a la inhibición del crecimiento de la planta, particularmente el de la raíz (Spaepen et al., 2007). Bioplaguicidas El control de fitopatógenos promueve el crecimiento vegetal de forma indirecta. La competencia por espacio o por nutrientes, permite que una PGPR eficiente en el uso de un determinado recurso reduzca el establecimiento y la persistencia de un patógeno. Ejemplo de ello es la producción de sideróforos, moléculas quelantes del hierro, que reducen la disponibilidad de éste elemento, convirtiéndolo en un factor limitante para el desarrollo de fitopatógenos (Pathma, Kennedy, & Sakthivel, 2011). La producción de sustancias que inhiben o degradan la pared del fitopatógeno, como es el caso de enzimas extracelulares anti-fúngicas y de antibióticos, son dos mecanismos de biocontrol que pueden converger en una misma cepa, tal como lo reporta Cazorla et al. (2007) para cinco cepas de Bacillus subtilis, quienes produjeron enzimas hidrolíticas tipo β glucanasas y proteasas, y lipopéptidos antibióticos como iturinas, fengicinas y surfactinas. La inducción de resistencia es un mecanismo basado en la activación de las defensas naturales de la planta, causada por la inoculación de microorganismos no patogénicos (Van Loon et al., 1998). Investigaciones realizadas por Murphy et al. (2000) reportan como cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis y Bacillus pumilus reducen tanto la incidencia como la severidad del Tomato mottle virus gracias a la inducción de resistencia sistémica en la planta Bacterias aeróbicas formadoras de endospora (BAFE) Las bacterias aeróbicas formadoras de endospora (BAFE) es un grupo que se caracteriza principalmente por su capacidad para formar un tipo de célula dormante muy resistente bajo condiciones de estrés, una estructura de resistencia denominada endospora (Driks, 2004). El conjunto de las BAFE está representado por aproximadamente 200 especies en 25 géneros, de los cuales Bacillus es el de mayor número de especies con 88, seguido por Paenibacillus con 45 (Fritze, 2004; Govindasamy et al., 2011). Cepas tanto del género Bacillus como del género Paenibacillus, han demostrado actividad promotora de crecimiento vegetal a través de mecanismos como la producción de sustancias reguladoras de crecimiento vegetal, la inhibición de la producción de etileno, la solubilización de fosfato, la producción de sideróforos, la inducción de resistencia sistémica a patógenos y la producción de antibióticos (A. Kumar et al., 2011), lo que demuestra que el grupo tiene un amplio espectro de rasgos bioquímicos y biológicos asociados a mecanismos directos e indirectos de promoción de crecimiento vegetal.

30 10 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño La formación de la endospora hace que las BAFE sean un grupo destacado dentro de la investigación en PGPR, puesto que dicha estructura facilita el aislamiento de las cepas a través de tratamientos con calor donde sobreviven las endosporas y se destruyen las células vegetativas; y permite además que las cepas tengan una mayor viabilidad bajo condiciones de campo, lo que potencializa su aplicación (Driks, 2004; Mandic-Mulec & Prosser, 2011; Mathre, Cook, & Callan, 1999) Bioprospección en PGPR La propuesta técnica del Plan Nacional en Bioprospección Continental y Marina desarrollado por Melgarejo et al. (2002) define bioprospección así: Temática y trabajo colectivo orientados a la búsqueda, conocimiento y selección de organismos o productos derivados, con uso actual o potencial en salud, alimentación, industria y medio ambiente, entre otros y su aprovechamiento sostenible en procesos productivos a escala industrial o artesanal, con aplicación nacional o internacional de los productos o servicios generados. Las PGPR por su papel como biofertilizantes, fitoestimuladores y bioplaguicidas son un objeto de estudio clave para los procesos de bioprospección agrícola, puesto que su capacidad para promover el crecimiento vegetal aportaría a reducir o reemplazar el uso de agroquímicos (Raj, Shetty, & Reddy, 2006), lo que permitiría proteger los recursos naturales, reducir la inversión económica, mejorar la competitividad (Moreno-Sarmiento, Moreno-Rodríguez, & Uribe-Vélez, 2006) y la calidad de vida de los productores y consumidores finales, es decir favorecería la sostenibilidad de los sistemas de producción (Singh, Pandey, & Singh, 2011). La elaboración de un insumo basado en PGPR, que es el producto tangible del proceso de bioprospección, presenta cuatro obstáculos principales (Arora, Khare, & Maheshwari, 2011): El proceso de búsqueda es largo y dispendioso y muchas veces no responde al reto particular de esta etapa de encontrar un microorganismo que promueva el crecimiento vegetal y además cumpla con características como alta competitividad en la rizósfera, amplio espectro de acción y tolerancia a condiciones extremas de temperatura y humedad. Altos costos de producción al requerir de cuidados especiales en todas las etapas del proceso. La vida útil del producto, puesto que las condiciones de almacenamiento de los productores no es la misma que tiene a disposición los distribuidores ni los consumidores finales, lo que disminuye la viabilidad del mismo. La inconsistencia en el desempeño del producto en campo. No obstante, el beneficio que el desarrollo exitoso de insumos biológicos representa para el sector agrícola sigue impulsando la investigación y el desarrollo industrial para sobrepasar dichos obstáculos. Según la encuesta realizada por Melgarejo et al. (2002) en el país los grupos de investigación dedicados al área de la microbiología se enfocan en su mayoría en áreas agrícolas como son: agentes de protección de cultivos agrícolas (23%), bioprocesos (16%), biofertilizantes (4%), y microbiología agrícola y del suelo (4%).

31 2. Problema de investigación y objetivos 2.1 Problema de investigación Planteamiento Las rizobacteria establecen interacciones que pueden ser positivas, neutras o negativas para el crecimiento de la planta. Aquellas bacterias con interacciones positivas son denominadas Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR) (J. Kloepper & Schroth, 1981) Las interacciones positivas de las PGPR se relacionan con incrementos en parámetros vegetales asociados a un mayor crecimiento y desarrollo (Lucy et al., 2004). La participación de las PGPR en el incremento o promoción del crecimiento vegetal, ha llevado a considerarlas como una alternativa encaminada a la reducción o posible eliminación del uso de agroquímicos (Banerjee et al., 2006; Raj et al., 2006). La generación de un producto comercial basado en PGPR actualmente presenta varios obstáculos metodológicos que van desde la búsqueda del microorganismo promisorio, hasta la formulación y almacenamiento del mismo (Arora et al., 2011; Mathre et al., 1999). La búsqueda del microorganismo a pesar de ser la etapa inicial de la bioprospección, es la que menos atención científica ha recibido, es decir, se realiza de forma mecánica por un gran número de grupos de investigación a nivel mundial, pero no de forma analítica, lo que trae como consecuencia el desconocimiento de las bases ecológicas que llevan a una bacteria a desarrollarse como PGPR, haciendo de la búsqueda un proceso dispendioso en el que las zonas a evaluar se escogen por razones ajenas a la ecología de los microorganismos. El conocimiento sobre la influencia de las condiciones bióticas y abióticas, particularmente la planta y el tipo de suelo, que afectan a la comunidad microbiana está en su mayoría relacionado con los efectos sobre su composición, riqueza y diversidad (Bååth & Anderson, 2003; Fierer & Jackson, 2006; Girvan et al., 2003; Lauber et al., 2009; Lemanceau et al., 1995; Smalla et al., 2001; Suzuki et al., 2009). Las investigaciones sobre el efecto de dichos factores en la distribución de poblaciones microbianas con rasgos bioquímicos y biológicos asociados a la promoción de crecimiento vegetal son pocos y se enfocan en uno o dos rasgos, lo que impide tener un contexto amplio de la posible selección que ejerzan estos aspectos en la presencia de PGPR. Adicionalmente, el hecho de que los estudios sean sobre la comunidad

32 12 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño microbiana, dificulta conocer con precisión la influencia del hábitat, ya que se incluyen variables fisiológicas propias de diferentes poblaciones. Un grupo importante dentro de las PGPR son las Bacterias Aeróbicas Formadoras de Endospora (BAFE). Gracias a su capacidad para generar estructuras de resistencia (la endospora) facilitan procesos de formulación de productos comerciales con una larga vida útil y bajos requerimientos de almacenamiento (Driks, 2004; Mathre et al., 1999), lo que las hace clave en la producción de insumos biológicos. No obstante, como se dijo anteriormente, no se tienen estudios que pudieran direccionar su búsqueda. La determinación de cómo los factores bióticos (la planta) y abióticos (el suelo), que definen el hábitat de las BAFE podrían seleccionar poblaciones con diferentes capacidades para promover el crecimiento vegetal, permitiría diseñar estrategias de bioprospección más eficientes para este grupo, orientadas específicamente a la función esperada Justificación En la actualidad Colombia tiene 3.4 millones de hectáreas sembradas, un área inferior al potencial de tierra arable del país, lo que convierte a Colombia, según la Organización de la Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO, por su sigla en inglés), en uno de los países con mayor potencial de expansión de tierras agrícolas en el mundo, crecimiento que es calculado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural en 10 millones de hectáreas (Sociedad de Agricultores de Colombia & PROEXPORT, 2012). El crecimiento del sector agrícola nacional, además de expandir las hectáreas cultivadas, debe incrementar la competitividad del sector dentro de los mercados nacionales e internacionales. Uno de los elementos que determina dicha competitividad es el costo de producción, y dentro de este el aspecto de mayor influencia es la adquisición de insumos, especialmente de fertilizantes y pesticidas (Moreno-Sarmiento et al., 2006). Los precios de los fertilizantes por lo general mantienen tendencias alcistas marcadas. Por ejemplo, de enero del 2007 a septiembre de 2008 se reportaron a nivel mundial alzas del 176% y del 319% en los costos de la urea y del fosfato diamónico (DAP) respectivamente, dos de los fertilizantes más empleados. Una tendencia, que si bien en el periodo mencionado se recrudeció debido a una serie de coyunturas globales demarcada entre otras circunstancias por la crisis energética, se ha mantenido, tal como se observó en el país en el periodo entre enero y julio del 2011 con los incrementos en los precios de los principales fertilizantes, como lo fueron: Urea (33.5%), Sulfato de amonio (12.2%), DAP (10.9%) y Cloruro de potasio (1.3%) (SIPSA, 2011.). Adicionalmente, los fertilizantes tienen una baja eficiencia, se sabe por ejemplo, que del total de Nitrógeno y Fósforo adicionado a los suelos en forma de fertilizantes el 50% del Nitrógeno y entre el 0.4 y el 90% del Fósforo no es asimilado por la planta (Simpson et al., 2011). La pérdida por lixiviación, erosión o por acomplejamiento hace que las aplicaciones se incrementen, elevando no sólo los costos de producción, sino también los problemas ambientales y de salubridad que de los agroquímicos se derivan.

33 Problema de investigación y Objetivos 13 Colombia, dada la alta dependencia a las importaciones de fertilizantes, en particular de Urea (30,8% del total de toneladas de fertilizantes importadas) (SIPSA, 2011.), sufre directamente las fluctuaciones en los precios internacionales. Es por ello que el desarrollo de bioinsumos producidos a nivel nacional, que logren reducir el uso de agroquímicos y que además sean amigables con el medio ambiente, ayudaría no sólo a amortiguar las variaciones en los costos, sino también a mejorar la competitividad del sector en un mercado que se preocupa cada vez más por el uso de tecnologías limpias y sostenibles. La generación de un producto comercial que sea de origen biológico tiene varias etapas: búsqueda del microorganismo, evaluación de su potencial como bioinsumo, producción, formulación y comercialización. Etapas en las que se pueden encontrar limitantes que dificultan, alargan e incrementan el costo del proceso desanimando a la industria (Melgarejo et al., 2002). Dados los beneficios que la implementación de los bioinsumos dan al sector agrícola, al medio ambiente y al consumidor final (Singh et al., 2011), es importante buscar estrategias que permitan optimizar la generación de los mismos, reduciendo costos y periodos de obtención. El conocimiento de los factores bióticos y abióticos que determinan la distribución de microorganismos benéficos para el sector agrícola, como es el caso de las PGPR, ayudaría a optimizar el proceso de bioprospección, un proceso que en la actualidad es dispendioso al requerir aislar y evaluar un gran número de morfotipos que provienen de muestreos diseñados sin fundamentos ecológicos suficientes, fundamentos que de tenerse en cuenta incrementarían la probabilidad de encontrar el microorganismo con la actividad deseada (Barriuso et al., 2008). El hecho de conocer los factores ecológicos que determinan la distribución de las BAFE en la rizósfera permitirá contribuir al conocimiento de la biología de este importante grupo funcional además de que permitiría mejorar la etapa de aislamiento y caracterización dentro del proceso de bioprospección necesaria para la generación de insumos biológicos. Esto aportaría a reducir la inversión económica y de tiempo, hecho que resulta atractivo para el sector académico, y más aún para el industrial, lo que impulsaría la producción e implementación de dichos productos Preguntas de investigación El hábitat, definido por la rizósfera, influirá en la selección de BAFE con actividades asociadas a promoción de crecimiento vegetal? Hábitats (rizósferas) contrastantes en términos de fertilidad del suelo y planta sembrada, seleccionarán cepas de BAFE con mecanismos de promoción de crecimiento vegetal diferentes? Uno de los dos factores que definen la rizósfera (planta o suelo) tendrá mayor influencia sobre la selección de los mecanismos de acción asociados a promoción de crecimiento vegetal en los aislados de BAFE?

34 14 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Hipótesis La interacción planta suelo influye en la selección de cepas de BAFE con actividad promotora de crecimiento vegetal. Los mecanismos asociados a la actividad promotora de crecimiento vegetal son seleccionados de forma diferencial por los hábitats contrastantes. Entre la planta y el suelo el factor de mayor influencia sobre la selección de grupos funcionales específicos de BAFE es la planta. 2.2 Objetivos Objetivo general Evaluar el efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora (BAFE) provenientes del Urabá antioqueño Objetivos específicos Establecer la presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE obtenidos de diferentes tipos de planta y suelo procedentes del Urabá antioqueño. Evaluar el efecto de la inoculación de los aislados de BAFE obtenidos, sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz. Determinar posibles relaciones entre las características del origen de los aislados de BAFE y su capacidad promotora de crecimiento vegetal.

35 15 3. Muestreo y aislamiento de BAFE La identificación de un gradiente natural de ph en los suelos del Urabá antioqueño, entre los municipio de Apartadó y Mutatá, y la determinación de la distribución de especies vegetales sobre todo el gradiente, brindaron las condiciones ideales para poder evaluar rizósferas contrastantes. El gradiente en términos de ph sobre una misma zona permitió tener suelos que comparten material parental, procesos de formación e historias de uso, pero que varían en la disponibilidad de nutrientes, un aspecto que de por sí le brinda a los suelos contraste en términos de sus características químicas. Con respecto a la planta se escogieron dos especies vegetales que contrastaran fuertemente en términos fisiológicos, la planta de iraca (Carludovica palmata), especie vegetal que se encontró ampliamente distribuida en el gradiente, y una especie cultivable, el maíz (Zea mays L.), esto con el fin de asegurar diferencias en términos de producción de exudados radiculares. El reconocimiento de la zona, la identificación de las especies vegetales, el muestreo y el aislamiento del grupo de BAFE, actividades descritas en el presente capítulo, se llevaron a cabo por el Dr. Camilo Ramírez y el investigador David Borrego del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia, miembros del equipo colaborador de este proyecto. Personal del herbario de la Universidad de Antioquia participó como asesor de las especies vegetales de la zona. 3.1 Zona de muestreo La zona escogida fue el Urabá antioqueño, una subregión del departamento de Antioquia que tiene una extensión de km 2 (18.6% del total del departamento), con ha cubiertas de bosques (IGAC & Departamento de Antioquia, 2007). La altura sobre el nivel del mar que predomina es entre 0 y 200 m, pero puede alcanzar los 3200 m en el nudo de Paramillo, con una temperatura promedio de 28ºC y una precipitación anual entre 2500 y 3500 mm. Su ubicación geográfica que limita con el Océano Atlántico, con la zona Andina y con la zona del Chocó Biogeográfico, hace que esta zona tenga condiciones favorables para una alta diversidad y riqueza (Dirección Planeación Estratégica Integral, 2010).

36 16 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño El muestreo se ubicó en la denominada zona centro de la subregión, zona que comprende los municipios de Apartadó, Carepa, Chigorodó, Mutatá y Turbo, y que se caracteriza por la prevalencia de un clima húmedo y ecosistemas de bosque húmedo (Dirección Planeación Estratégica Integral, 2010). El gradiente natural de ph encontrado en los suelos de la zona central comprende entre ph 6.6 en los municipios del norte y 4.9 en los municipios del sur. Al parecer el gradiente corresponde a una climosecuencia, teniendo los valores más altos de precipitación hacia el sur y los más bajos hacia el norte. Las plantas escogidas fueron iraca (Carludovica palmata) y maíz (Zea mays L.). La iraca de la familia Cyclanthaceae, se encontró distribuida en toda la zona central del Urabá antioqueño y el maíz, perteneciente a la familia Poaceae, fue sembrada en los suelos donde crecían las iracas. Aunque ambas especies son monocotiledóneas y carecen de estructuras leñosas, varían en hábito de crecimiento, lo que permite asegurar diferencias fisiológicas y contraste en el efecto rizosférico que genera cada una. 3.2 Muestreo En los municipios de la zona central de la subregión del Urabá antioqueño se escogieron 8 puntos de muestreo (Figura 3-1), cada punto contaba con la presencia de plantas de iraca. Inicialmente, se buscó sembrar en los puntos de muestreo plantas de maíz de la variedad ICA 109 para clima cálido, sin embargo el ataque constante de hormigas arrieras dificultó esta tarea, por lo que finalmente se tomaron suelos de cada punto y bajo condiciones de invernadero, en las instalaciones del Centro de Investigaciones del Banano (CENIBANANO), ubicado en el municipio de Carepa, se dejó crecer por dos meses las plantas de maíz, con lo que se logró obtener para cada punto de muestreo o suelo, el crecimiento de los dos tipos de planta escogidas. Figura 3-1: Mapa de la zona de muestreo ubicando los ocho puntos donde se tomaron muestras. Se puede observar la ubicación de la zona a nivel departamental y nacional.

37 Muestra y Aislamiento de BAFE 17 Las muestras de suelo rizosférico de cada punto y de cada planta fueron recolectados y trasladados al laboratorio de control microbiológico de la Universidad de Antioquia para el aislamiento selectivo de las BAFE. Los suelos de cada punto de muestreo fueron analizados en el laboratorio de suelos de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. El resultado de la caracterización fisicoquímica se presentan en la Tabla 3-1. Con los resultados de la caracterización de los suelos se buscó alguna posible agrupación entre ellos, encontrando a través de un análisis de componentes principales realizado en el programa RGui (R Core Team, 2012), que los suelos provenientes de los municipios del norte (Puntos 1, 2, 3 y 4) se agrupaban al lado derecho del eje vertical, destacándose por tener ph superiores a 5.5, por sus valores de capacidad de intercambio catiónico efectivo (CICE), materia orgánica y por el porcentaje superior de arcillas. Por su lado los suelos de los municipios del sur (Puntos 5, 6, 7 y 8) se agruparon al lado izquierdo, caracterizándose por su ph inferior a 5.5 y por tener Al intercambiable (Figura 3-2). Es decir que las características físicas y químicas, especialmente el ph y la CICE efectivamente sirvieron como parámetros para distinguir las zonas de muestreo, en este caso se logró encontrar una diferenciación marcada a nivel de características fisicoquímicas relacionadas con la disposición de nutrientes. Este resultado motivó la agrupación de las muestras provenientes del norte y del sur, denominándolas como suelos de fertilidad alta y baja, respectivamente. Figura 3-2: Análisis de componentes principales para las características fisicoquímicas de los suelos de los ocho puntos de muestreo. El componente 1 explica el 44.9% de la variación y el componente 2 el 23.8%.

38 18 Tabla 3-1: Análisis fisicoquímico de los ocho puntos de muestreo. Zona Textura ph %MO %CO Al Ca Mg K CICE P S Fe Mn Cu Zn B Arena Limo Arcilla cmolc kg-1 mg kg ph (método: Agua 1:1), Materia orgánica (MO; método: Walkley Black), Al (método: KCl 1M), Ca, Mg, K (método: acetato de amonio 1M), Capacidad de intercambio catiónico efectivo (CICE; método: suma de cationes de cambio), S (método: fosfato monocálcico 0.008M), Fe, Mn, Cu, Zn (método: Olsen EDTA), B (método: agua caliente), y P (método: Bray II )

39 Muestreo y Aislamiento de BAFE Aislamiento selectivo de BAFE Las muestras de suelo rizosférico fueron llevadas al laboratorio de Control Microbiológico de la Universidad de Antioquia donde se llevó a cabo el proceso de aislamiento de las BAFE siguiendo el protocolo utilizado por Ramírez (2010) el cual brevemente consiste en hacer diluciones seriadas, partiendo de 10 gr de suelo en 10 ml de agua destilada estéril, luego someter a calentamiento (80 C por 15 min) con el fin de aislar selectivamente las esporas, y sembrar algunas diluciones seriadas en medio TSA. Luego de una incubación a 27+1 C se seleccionaron todas las colonias que parecieran fenotípicamente diferentes a criterio del investigador David Andrés Borrero de la Universidad de Antioquia encargado de este proceso. La cantidad de cepas obtenidas por punto de muestreo y planta se muestran en la Tabla 3-2. Tabla 3-2: Número de morfotipos obtenidos para los ocho puntos de muestreo, diferenciando además por planta. Grupo Zona Planta Número de morfotipos Iraca 12 1 Maíz 10 Iraca 11 2 Maíz 13 Fertilidad alta Iraca 13 3 Maíz 8 Iraca 10 4 Maíz 5 Iraca 7 5 Maíz 9 Iraca 8 6 Maíz 9 Fertilidad baja Iraca 11 7 Maíz 11 8 Iraca 6 Maíz 5

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41 4. Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE Se ha reportado ampliamente que las BAFE presentan varios rasgos bioquímicos y biológicos asociados a la actividad promotora de crecimiento vegetal (A. Kumar et al., 2011). Rasgos que se asocian con todos las categorías de mecanismos de acción de las PGPR, lo que las hace un grupo de estudio llamativo, ya que se tiene la posibilidad de encontrar en un mismo grupo y hasta en un mismo microorganismo varios mecanismos que aportan al crecimiento vegetal. Como el objetivo en este capítulo es caracterizar los 148 aislamientos en términos de su actividad como promotores de crecimiento vegetal, se evaluó un rasgo asociado a cada mecanismo de acción conocido para las PGPR: Capacidad como biofertilizante, se midió su potencial como solubilizadoras de fosfatos de calcio, de hierro y de aluminio, las tres fuentes principales de fósforo inorgánico que se encuentran en el suelo (Khan et al., 2009). La abundancia de cada fuente depende del ph del suelo, condición propicia para comparar el potencial de los aislamientos, dada la presencia de cepas provenientes de suelos con ph por encima y por debajo de 5.5. Capacidad como fitoestimulante, se evalúo la producción de AIA y ACC deaminasa, AIA por ser la auxina más común y una de las fitohormonas más asociadas al crecimiento vegetal, y la ACC deaminasa por la importancia de ésta enzima en la promoción del crecimiento bajo condiciones de estrés (Spaepen et al., 2007). Finalmente, la capacidad como bioplaguicida se probó a través del antagonismo contra tres hongos fitopatógenos (Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum). Los hongos escogidos son reconocidos por las enfermedades que producen en cultivos de importancia económica. Rhizoctonia solani AG-3 principalmente en cultivos de papa (Tsror, 2010), Botrytis cinerea con un amplio registro de enfermedades poscosecha en vegetales (brócoli, lechuga, repollo), frutas (uvas, fresas, moras) y flores de corte (rosa y gerbera) (Williamson et al., 2007), y Fusarium oxysporum, especie conocida por tener más de 150 formas especiales descritas para cada planta hospedera (Baayen et al., 2000).

42 22 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño La caracterización inicial de las cepas permitió tener una visión integral del potencial de las BAFE como promotoras de crecimiento vegetal, asociando dicha capacidad de forma descriptiva con las condiciones contrastantes del hábitat de origen descritas en la sección 3.1. A continuación se describirá la metodología y los resultados, y se discutirá lo obtenido. 4.1 Metodología De acuerdo a las actividades descritas en la sección 3.3, se obtuvieron 148 aislamientos representativos de las ocho zonas bajo estudio. Dichos aislamientos, se recibieron en el laboratorio de Microbiología Agrícola del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, se confirmó su viabilidad y pureza y posteriormente fueron criopreservadas en glicerol a -70 y -20 C Preparación de Inóculo Las cepas criopreservadas y almacenadas a -20 C fueron reactivadas en Agar Tripticasa de Soya (TSA), de dicho medio se tomó una colonia que fue sembrada en 5 ml de caldo TSB, incubando por 24 horas a 29 C. Transcurrido el tiempo de incubación se procedió a lavar dos veces la biomasa producida con solución salina (NaCl) al 0.85%, para finalmente ajustar la concentración celular a una densidad óptica de a 600 nm, utilizando un Espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 20 Modelo 4001/ Solubilización de fosfatos Para llevar a cabo esta caracterización, se decidió hacer una determinación cuantitativa de la capacidad de solubilización de fosfato para cada uno de los aislamientos. Esta aproximación tiene como objeto evitar descartar cepas que tengan el potencial de solubilizar fósforo inorgánico, pero que en una prueba cualitativa (ej: evaluación de halos de solubilización), no produzcan halos, situación que se puede presentar debido a tasas diferenciales de difusión de los ácidos orgánicos secretados por el microorganismo en el agar, los cuales son responsables de la solubilización de los fosfatos, i.e. una difusión lenta impide la formación del halo y por ende la detección de su capacidad de solubilización (Nautiyal, 1999). De esta forma, al emplear un medio líquido, se evita dicha limitación y se logra detectar, de una manera más confiable, la capacidad de solubilización. La evaluación cuantitativa de la capacidad solubilizadora de fosfatos de los aislamientos se realizó en medio líquido NBRIP con ph 7 (Nautiyal, 1999) siguiendo la prueba analítica del Spectroquant Fósforo de Merck, según indicaciones del productor. Brevemente, el método consistió en suplementar 15 ml del medio con una de las tres fuentes inorgánicas de fosfatos a evaluar (fosfato tricálcico, fosfato de aluminio y fosfato de hierro a concentraciones de 0.5, 0.1 y 0.3% respectivamente), para posteriormente agregar 150µL de inóculo, el cual fue preparado como se describió en la sección Luego de 5 días de incubación a 150 rpm y 27 C se cuantificó la actividad solubilizadora a través de la concentración del ácido molibdovanadato fosfórico, un complejo amarillo formado por la reacción del molibdovanadato (presente en el reactivo Spectroquant

43 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 23 Fósforo de Merck) con los iones de ortofosfato que se encuentran libres en la muestra, la detección del complejo se llevó a cabo por colorimetría (λ = 405 nm) en un lector de microplato BIORAD Modelo 550. La curva de calibración se realizó con una solución estándar de K 2 HPO 4 a una concentración de 500mg/L, llevándola a diferentes concentraciones con agua destilada desde 0.0 hasta mg/l de fosfato soluble. Las mediciones se llevaron a cabo con el mismo procedimiento descrito para las muestras (Anexo A) Para cada una de las cepas a evaluar se realizaron tres réplicas por cada una de las tres fuentes inorgánicas de fosfatos, utilizando como control positivo la cepa Pseudomonas sp. (IBUN 095) (Lara, 2007) y como control negativo un tratamiento sin inoculación de microorganismo, pero incubado bajo las mismas condiciones para cada fuente de fosfatos. El valor obtenido para el control negativo fue restado al resultado de cada muestra, esto con el fin de conocer la verdadera cantidad de fosfatos que fue solubilizado por la actividad de las cepas evaluadas. Para correlacionar la capacidad solubilizadora de las tres fuentes de fosfato se realizó el estadístico no paramétrico de Spearman (ρ), con un nivel de significancia del Los análisis se realizaron con el programa R Studio (R Core Team, 2012) Producción de compuestos indólicos El procedimiento para evaluar la producción de indoles se realizó siguiendo el procedimiento de (Glickmann & Dessaux, 1995), el cual consistió en sembrar 100µL de inóculo, preparado como se describió en la sección 4.1.1, en 10mL de caldo LB suplementado con una solución de 3mM de triptófano. La incubación se llevó a cabo en frascos ámbar por 3 días, a 150 rpm y una temperatura de 30 C. Luego de la incubación una alícuota de la muestra fue mezclada con reactivo de Salkowski en una proporción 1:1, dicho reactivo permite la oxidación de los compuestos indólicos gracias a las sales férricas que contiene y al ambiente ácido que produce, dicha reacción permite cuantificar colorimétricamente (λ= 540 nm) la cantidad de índoles presentes en la muestra. La cuantificación colorimétrica se realizó con un Espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 20 Modelo 4001/4. La curva de calibración se realizó con una solución estándar de ácido indol acético (AIA) de 1 mg/ml, llevándola a diferentes concentraciones con medio LB, desde 2 hasta 20 µg/ml de AIA. Las mediciones se llevaron a cabo con el mismo procedimiento descrito para las muestras (Anexo B). La evaluación de cada cepa se realizó por triplicado, como control positivo se empleó la cepa G 10 de Enterobacter hormaechei, identificada previamente como una buena productora de compuestos indólicos (Vanegas, 2007) y como control negativo un tratamiento sin ningún tipo de inoculación microbiana. El valor obtenido para el control negativo fue restado al resultado de cada muestra, con el fin de corregir y establecer la verdadera cantidad de compuestos indólicos producidos por la acción de las cepas.

44 24 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Producción de ACC deaminasa El método para evaluar la producción de ACC deaminasa se basa en la capacidad del microorganismo para crecer en un medio que tiene como única fuente de nitrógeno al ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC.). El medio que se utilizó fue el medio mínimo de Spizizen (SMM, por su sigla en inglés)(spizizen, 1958) tal como lo propone Ramírez (2010) para el estudio de BAFE. La prueba consistió en sembrar una asada de una solución 1 x 10 8 esporas/ml de la cepa a evaluar en el medio SMM con ACC como única fuente de nitrógeno (SMM+ACC), otra en el medio SMM con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno (SMM+N), y otra en medio SMM sin fuente de nitrógeno (SMM.). Se dejó en incubación por 72h a 25 C. Cada aislamiento fue evaluado por triplicado, utilizando una misma caja de Petri para evaluar hasta 10 cepas. Se empleó como control positivo la cepa 208 de Pseudomonas sp. proporcionada por el Dr. Camilo Ramírez del Grupo en Biocontrol y Microbiología Ambiental del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia, Colombia. Se consideró como resultado positivo al microorganismo que creció en los medios SMM+ACC y SMM+N, y que no creció en el medio SMM (Figura 4-1). Figura 4-1: Evaluación de la producción de ACC deaminasa, se resalta en el ovalo azul el resultado positivo como productora de ACC deaminasa de la cepa 208 de Pseudomonas sp (control positivo de la prueba). Los medios empleados fueron SMM con ACC como única fuente de nitrógeno (SMM+ACC), medio SMM con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno (SMM+N), y medio SMM sin fuente de nitrógeno (SMM.).

45 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE Capacidad antagónica contra diferentes agentes fitopatógenos Se evaluó la capacidad antagónica, siguiendo el procedimiento sugerido por Bautista, Mendoza, and Uribe (2007), contra tres hongos fitopatógenos: Rhizoctonia solani grupo de anastomosis AG-3, facilitado por la profesora Celsa García del Grupo de Investigación en Papa de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional sede Bogotá; Fusarium oxysporum, aislado por Silvia Bustamante de cultivo de tomate por el Grupo de Investigación en Ñame del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional sede Bogotá; y Botrytis cinerea, aislado de cultivos de mora (Medina, Cristancho, & Uribe, 2009). Brevemente, dicha prueba consistió en sembrar una colonia de los aislamientos reactivados en agar TSA en medio PDA en forma de estría, sobre dos líneas paralelas equidistantes al centro de la caja de Petri. Luego de 48 horas de incubación se colocó en el centro de la caja un cuadrado de agar de 25 mm 2 de área con micelio del respectivo hongo y se dejó en incubación por diferentes tiempos dependiendo del hongo a evaluar: 5 días a 27 C las cajas con Rhizoctonia solani, 6 días a 27 C las correspondientes a Botrytis cinerea y 9 días a 30 C las de Fusarium oxysporum. Como control negativo se sembró un cuadrado del hongo en el centro de una caja de Petri que no tuviera presencia de las cepas a evaluar, y como control positivo se utilizó la cepa de Bacillus sp. AP188 amablemente proporcionada por el Dr. Joseph Kloepper de la Universidad de Auburn, Estados Unidos. Cada cepa fue evaluada por triplicado. Transcurrido el tiempo de incubación se constató con la caja del control negativo que el hongo hubiese crecido hasta el borde de la caja, confirmado esto se procedió a clasificar las cepas como positivas (Figura 4-2A), para aquellas que produjeron un halo de inhibición del crecimiento del hongo, limitantes las que no permitieron un crecimiento micelial más allá de la estría donde se encontraba la cepa (Figura 4-2B) y negativas aquellas que permitieron el crecimiento del hongo hasta el borde de la caja (Figura 4-2C). Figura 4-2: Categoría de inhibición de los hongos fitopatógenos obtenidos en la prueba de antagonismo. A. Cepa positiva, producción de halo de inhibición del crecimiento del hongo. B. Cepa limitante, el crecimiento del hongo no sobrepasa la estría donde creció la bacteria, caso observado al lado izquierdo de la foto. C. Cepa negativa, el crecimiento del hongo no se detiene y pasa por encima de las bacterias. A B C

46 26 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño A todas las cepas que presentaron resultados positivos, es decir formación de halo, se les midió el área de inhibición a través del programa Rhinoceros 4.0 (McNeel & Associates, 2006), tal como se muestra en la Figura 4-3. La similitud estadística entre el área de las cepas y la del control se determinó a través de la prueba de múltiples comparaciones de Tukey con un nivel de significancia del Figura 4-3: Área de inhibición de crecimiento del hongo producida por la BAFE. Se señala con amarillo el área que fue medida y registrada para cada cepa con resultado positivo. 4.2 Resultados Solubilización de Fosfato Solubilización de Fosfato de Calcio La cantidad de fosfato de calcio solubilizado fue categorizado en tres niveles: 1. de 0.0 a 20 mg/l; 2. de a 200 mg/l; y 3. mayor a 200 mg/l. Cuatro cepas no presentaron la actividad, siendo cada una de una de las categorías de origen, por lo que representaban un porcentaje que no ameritaba una categoría propia. La cepa control a lo largo de las pruebas tuvo un valor de mg/l, el rango obtenido para las cepas fue de 0.25 a mg/l. Los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de fertilidad alta mostraron que el 35% (16) pertenecen a la categoría 1, el 56% (26) a la 2, y el 9% (4) a la 3 (Figura 4-4A). De los aislamientos también de iraca, pero provenientes de suelos con un nivel bajo de fertilidad se puede decir que el 41% (13) hacen parte de la categoría 1, el 53% (17) a la 2, y el 3% (2) a la 3 (Figura 4-4B). Con respecto a los aislados de maíz, los provenientes de suelos con alta fertilidad mostraron que el 25% (9) pertenecen a la categoría 1, el 56% (20) a la 2, y el 19% (7) a

47 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 27 la 3 (Figura 4-4C); los de suelos con baja fertilidad mostraron que el 41% (14) pertenecen a la categoría 1, el 47% (16) a la 2, y el 12% (4) a la 3 (Figura 4-4D). Figura 4-4: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada uno de las tres categorías en mg/l establecidas para la capacidad solubilizadora de Fosfato de Calcio. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.). A. B. C. D. Solubilización de Fosfato de Hierro Las categorías empleadas para clasificar la cantidad de fosfato de hierro solubilizado por los aislamientos fueron tres: 1. 0 mg/l, para los aislamientos que no solubilizaron fosfato; 2. de 0.1 a 3 mg/l; y 3. mayor a 3 mg/l. La cepa control a lo largo de las pruebas tuvo un valor de 2.05 mg/l, el rango obtenido para las cepas fue de 0.04 a mg/l. Los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de fertilidad alta mostraron que el 9% (4) pertenecen a la categoría 1, el 69% (32) a la 2, y el 22% (10) a la 3 (Figura 4-5A). Los provenientes de suelos con un nivel bajo de fertilidad mostraron

48 28 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño que el 19% (6) hacen parte de la categoría 1, el 62% (20) a la 2, y el 19% (6) a la 3 (Figura 4-5B). Con respecto a los aislados de maíz, los provenientes de suelos con alta fertilidad mostraron que el 25% (9) pertenecen a la categoría 1, el 44% (16) a la 2, y el 31% (11) a la 3 (Figura 4-5C). De los aislamientos también de maíz, pero provenientes de suelos con baja fertilidad se puede decir que tuvieron un 18% (6) pertenecientes a la categoría 1, un 50% (17) a la 2, y un 32% (11) a la 3 (Figura 4-5D). Figura 4-5: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada uno de las tres categorías en mg/l establecidas para la capacidad solubilizadora de Fosfato de Hierro. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.). A. B. Solubilización de Fosfato de Aluminio C. D. Se emplearon las mismas tres categorías descritas para la capacidad solubilizadora de fosfato de hierro. La cepa control a lo largo de las pruebas tuvo un valor de 2.21 mg/l, el rango obtenido para las cepas fue de 0.15 a mg/l. Los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de fertilidad alta mostraron que el 13% (6) pertenecen a la categoría 1, el 59% (27) a la 2, y el 28% (13) a la 3 (Figura 4-6A). Los provenientes de suelos con un nivel bajo de fertilidad mostraron que el 9% (3) hacen parte de la categoría 1, el 47% (15) a la 2, y el 44% (14) a la 3 (Figura 4-6B).

49 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 29 Los aislados de maíz provenientes de suelos con alta fertilidad mostraron que el 22% (8) pertenecen a la categoría 1, el 50% (18) a la 2, y el 28% (10) a la 3 (Figura 4-6C); los de suelos con baja fertilidad mostraron que el 9% (3) pertenecen a la categoría 1, el 53% (18) a la 2, y el 38% (13) a la 3 (Figura 4-6D). Figura 4-6: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada uno de las tres categorías en mg/l establecidas para la capacidad solubilizadora de Fosfato de Aluminio. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.). A. B. C. D. Relación entre la solubilización de diferentes fuentes de fosfato El análisis de correlaciones mostró que la capacidad solubilizadora de fosfato de calcio y de aluminio están asociadas positivamente (ρ = 0.319; p-valor= e-05), relación que se observa en la Figura 4-7B y que resalta particularmente a cinco cepas que solubilizaron más de 10 mg/l de fosfato de aluminio y más de 300 mg/l de fosfato de calcio. Estas cepas (MA3C2, IA1C8, IM4C2, IT1C7, IT2C9) son en su mayoría provenientes de la rizósfera de iraca, siendo 3 de suelos con alta fertilidad y una de nivel bajo; la única cepa proveniente de maíz es de suelos con alta fertilidad. La capacidad solubilizadora de fosfato de hierro y aluminio también está relacionada positivamente (ρ = 0.317; p-valor= E -5), en esta correlación se destacan siete

50 30 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Figura 4-7: Relación de la capacidad solubilizadora de fosfato combinando por pares las tres fuentes empleadas. (A.) Fosfato de calcio y de hierro, (B.) Fosfato de calcio y de aluminio y (C) Fosfato de hierro y aluminio. Los símbolos representan los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de alta ( ) y baja fertilidad ( ) y las cepas provenientes de la rizósfera de maíz con suelos de alta ( ) y baja fertilidad ( ) A. B. C

51 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 31 cepas que solubilizaron más de 10 mg/l de fosfato de hierro y entre 3.5 y 10.2 mg/l de fosfato de aluminio (Figura 4-7C). Estas cepas (MGC3, MT1C7, MT2C2, MM4C7, MT2C4, IM4C3, IT1C10), en contraste con las señaladas en la correlación positiva entre la capacidad solubilizadora de fosfato de calcio y aluminio, son en su mayoría provenientes de la rizósfera de maíz, siendo 2 de suelos con baja fertilidad y 3 de alta; las dos que provienen de iraca son cada una de un nivel de fertilidad diferente. La correlación entre la solubilización de fosfato de calcio y de hierro no dio significativa (ρ = 0.012; p-valor= 0.882). Sin embargo, se observa que las cepas con mayor capacidad solubilizadora del fosfato de hierro (por encima de 10mg/L) tuvieron valores bajos (por debajo de 50 mg/l) de solubilización de fosfato de calcio, así como los valores más altos de fosfato de calcio solubilizado (más de 300 mg/l) se relacionan con valores bajos (menos de 3.5 mg/l) de fosfato de hierro solubilizado (Figura 4-7A), lo que podría sugerir una relación inversa entre estas dos capacidades, aunque esta no dio estadísticamente significativa Producción de compuestos indólicos La producción fue categorizada en 3 rangos: 1. de 0.2 a 4 µg/ml, 2. de 4.01 a 10 µg/ml, 3. Mayor a µg/ml. La cepa control a lo largo de las pruebas tuvo un valor de µg/ml, el rango obtenido para las cepas fue de 0.2 a µg/ml. Para los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca y de suelos con alta fertilidad, se encontró que el 72% (33) pertenecieron al rango 1, el 19% (9) al 2, y el 9% (4) al rango 3 (Figura 4-8A). Las cepas provenientes también de la rizósfera de iraca, pero de suelos con baja fertilidad mostraron que el 72% (23) corresponden al rango 1, el 12% (4) al 2, y el 16% (5) al 3 (Figura 4-8B). Para los aislamientos provenientes de la rizósfera de maíz en suelos con alta fertilidad se encontró que el 42% (15) pertenecieron al rango 1, el 19% (7) al 2, y el 39% (14) al rango 3 (Figura 4-8C). Las cepas provenientes también de la rizósfera de maíz, pero de suelos con baja fertilidad mostraron que el 38% (13) fueron del rango 1, el 18% (6) del 2, y el 44% (15) del 3 (Figura 4-8D) Producción de ACC deaminasa De los 148 aislamientos evaluados ninguno mostró un resultado que pudiera considerarse positivo. Es importante destacar que en el medio SMM + ACC se podía observar un crecimiento leve de las cepas, no obstante, este se debía a la cantidad mínima de nitrógeno que el agar contenía y que servía como fuente inicial del nutriente. El control realizado en medio SMM mostró la misma intensidad de crecimiento lo que permitió soportar la hipótesis descrita anteriormente y evitar así falsos positivos.

52 32 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Figura 4-8: Porcentaje de las cepas pertenecientes a cada una de las tres categorías establecidas en µg/ml para la producción de compuestos indólicos. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.). A. B. C. D Capacidad antagónica contra diferentes agentes fitopatógenos Capacidad antagónica contra Rhizoctonia solani La evaluación frente a Rhizoctonia solani mostró que de los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de alta fertilidad el 19% (9) fueron positivas, el 33% (15) limitantes y el 48% (22) negativas (Figura 4-9A); de la rizósfera de iraca con suelos de baja fertilidad el 50% (16) fueron positivas, el 25% (8) limitantes y el 25% (8) negativas (Figura 4-9B). De los aislamientos provenientes de la rizósfera de maíz con suelos de alta fertilidad el 17% (6) fueron positivas, el 25% (9) limitantes y el 58% (21) negativas (Figura 4-9C); de la rizósfera de maíz con suelos de baja fertilidad el 35% (12) fueron positivas, el 15% (5) limitantes y el 50% (17) negativas (Figura 4-9D).

53 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 33 Figura 4-9: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada una de las tres categorías de inhibición establecidas, prueba contra Rhizoctonia solani. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.) A. B. C. D. El área de inhibición de las cepas positivas mostró para las 26 cepas provenientes de iraca que 17, la mayoría, fueron aisladas de suelos con baja fertilidad, y 9 de suelos con alta fertilidad. Al comparar estadísticamente el área de las cepas y del control se encontró que 3 cepas fueron iguales a AP188 (Figura 4-10A). Las cepas de maíz por su parte no fueron estadísticamente iguales al control, todas ellas presentaron un área de inhibición inferior al hallado para la cepa AP188. Sin embargo, al igual que las cepas provenientes de iraca la mayoría de los aislamientos positivos fueron de suelos con baja fertilidad, 13 cepas de 18, siendo únicamente 5 de suelos de alta fertilidad (Figura 4-10B).

54 34 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Figura 4-10: Área de inhibición del crecimiento micelial de Rhizoctonia solani producida por cepas provenientes de la rizósfera de de iraca (Carludovica palmata) (A.) y de maíz (Zea mays) (B.), diferenciando el nivel de fertilidad del suelo de donde provienen. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. Los asteriscos (*) señalan las medidas estadísticamente similares al control con un nivel de significancia del A. B. Capacidad antagónica contra Botrytis cinerea Con respecto a Botrytis cinerea, se encontró que de los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de alta fertilidad el 26% (12) fueron positivas, el 20% (9) limitantes y el 54% (25) negativas (Figura 4-11A); de la rizósfera de iraca con suelos de

55 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 35 baja fertilidad el 50% (16) fueron positivas, el 25% (8) limitantes y el 25% (8) negativas (Figura 4-11B). De los aislamientos provenientes de la rizósfera de maíz con suelos de alta fertilidad el 17% (6) fueron positivas, el 28% (10) limitantes y el 55% (20) negativas (Figura 4-11C); de la rizósfera de maíz con suelos de baja fertilidad el 15% (5) fueron positivas, el 26% (9) limitantes y el 59% (20) negativas (Figura 4-11D). Figura 4-11: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada una de las tres categorías de inhibición establecidas, prueba contra Botrytis cinerea. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.). A. B. C. D. De las 28 cepas positivas aisladas de la rizósfera de iraca, 10 presentaron un área de inhibición estadísticamente similar al control. La mayoría de las cepas positivas pertenecen a suelos de baja fertilidad (Figura 4-12A), situación contraria a lo observado por parte de las cepas provenientes de maíz, en las que fue similar el número de cepas positivas para cada nivel de fertilidad. De las 11 cepas de maíz, 5 fueron estadísticamente similares al control (Figura 4-12B).

56 36 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Figura 4-12: Área de inhibición del crecimiento micelial de Botrytis cinerea producida por cepas provenientes de la rizósfera de de iraca (Carludovica palmata) (A.) y de maíz (Zea mays) (B.), diferenciando el nivel de fertilidad del suelo de donde provienen. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. Un asterisco (*) señala las medidas estadísticamente similares, dos asteriscos (**) la medida superior al control, ambos con un nivel de significancia del A. B.

57 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 37 Capacidad antagónica contra Fusarium oxysporum Las pruebas contra Fusarium oxysporum mostraron que de los aislamientos provenientes de la rizósfera de iraca con suelos de alta fertilidad el 12% (6) fueron positivas, el 2% (1) limitantes y el 85% (39) negativas (Figura 4-13A); de la rizósfera de iraca con suelos de baja fertilidad el 37% (12) fueron positivas, el 0% (0) limitantes y el 63% (20) negativas (Figura 4-13B). De los aislamientos provenientes de la rizósfera de maíz con suelos de alta fertilidad el 6% (2) fueron positivas, el 0% (0) limitantes y el 94% (34) negativas (Figura 4-13C); de la rizósfera de maíz con suelos de baja fertilidad el 9% (3) fueron positivas, el 6% (2) limitantes y el 85% (29) negativas (Figura 4-13D). Figura 4-13: Porcentaje de las cepas que pertenecen a cada una de las tres categorías de inhibición establecidas, prueba contra Fusarium oxysporum. Cepas de la rizósfera de iraca (Carludovica palmata) con suelos de alta (A.) y baja fertilidad (B.). Cepas de la rizósfera de maíz (Zea mays) con suelos de alta (C.) y baja fertilidad (D.). A. B. C. D.

58 38 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño De las 18 cepas provenientes de iraca que fueron positivas en la producción de un área de inhibición, 12 pertenecen a los suelos de baja fertilidad y 6 a los de alta fertilidad. La mayoría de las áreas de inhibición de las cepas fueron estadísticamente similares a la cepa control (AP188) (Figura 4-14A). Con respecto a las cepas aisladas de la rizósfera de maíz, sólo 4 fueron positivas, de ellas 3 tuvieron el área similar al control positivo (Figura 4-14B). Figura 4-14: Área de inhibición del crecimiento micelial de Fusarium oxysporum producida por cepas provenientes de la rizósfera de de iraca (Carludovica palmata) (A.) y de maíz (Zea mays) (B.), diferenciando el nivel de fertilidad del suelo de donde provienen. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. Los asteriscos (*) señalan las medidas estadísticamente similares al control con un nivel de significancia del A. B.

59 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE Discusión El rango obtenido para la solubilización de fosfato de calcio fue de 0.25 a mg/l, teniendo 17 cepas que solubilizaron más de 200 mg/l, es decir el 11.5%, y concentrando la mayoría de los aislamientos, más del 50%, en la categoría de a 200 mg/l. Valores que resultan ser similares a lo obtenido por otros investigadores para cepas de BAFE, como lo reportado por Kadyan, Panghal, Singh, and Yadav (2013), quienes encontraron un rango de 9 a 125 mg/l, donde sólo 6 cepas de las 52 que evaluaron tienen una capacidad inferior a 20 mg/l, y 7 no presentaron la actividad; otras investigaciones son la de Chen et al. (2006), en la que aislaron 36 cepas solubilizadoras de fosfato de suelos sin historia de uso, de las cuales 10 fueron identificadas como Bacillus megaterium con un rango de solubilización de 72.2 a mg/l; y la de Anzuay et al. (2013), en la que aislaron 19 cepas endófitas con capacidad solubilizadora de las cuales 5 pertenecen al género Bacillus reportando para éstas un rango de 12.9 a 202 mg/l. Con respecto a las cepas con niveles superiores de solubilización, Ratón et al. (2012) también encontraron cepas BAFE con valores altos, el rango para las 18 cepas de BAFE que caracterizaron fue de a mg/l, teniendo 14 cepas con valores por encima de los 200 mg/l. Estos rangos altos de solubilización no son comunes para las BAFE, aunque han sido reportados para otros géneros como Arthrobacter y Serratia (Chen et al., 2006), lo que llama la atención particularmente sobre dichos aislamientos, puesto que entre mayor sea la capacidad solubilizadora, mayor será el aporte a la nutrición de la planta, específicamente la relacionada con la disponibilidad de fósforo. Para el caso de la solubilización de fosfato de hierro y aluminio se encontraron rangos similares para ambas fuentes, entre 0.04 y mg/l para el fosfato de hierro y entre 0.15 y mg/l para el fosfato de aluminio. La caracterización de la capacidad solubilizadora de estas fuentes de fosfato no es común en las investigaciones, la metodología estándar y por ende la más utilizada, es la producción de halos en medios suplementados con fosfato tricálcico como única fuente de fósforo, no obstante, estudios como el realizado por Perez, Sulbaran, Ball, and Yarzabal (2007) destacan un punto importante, que es la presencia mayoritaria de suelos ácidos en el trópico, suelos que por sus condiciones van a acumular el fósforo precisamente como fosfatos de hierro y aluminio, de allí la relevancia de evaluar las cepas con estas fuentes para poder aplicarlas y movilizar el fósforo de estos suelos. Tanto los rangos como la cantidad de aislamientos con la capacidad de solubilizar fosfato de hierro y aluminio fueron menores a los encontrados para el fosfato de calcio, resultados que también han sido reportados para comunidades microbianas de cultivos de maíz (Oliveira et al., 2009) y de suelos ácidos (Perez et al., 2007), en ninguno de estos trabajos encontraron BAFE solubilizadoras de fosfato de hierro, ni de aluminio. La menor capacidad para solubilizar estas dos fuentes de fosfato puede deberse a la baja solubilidad de ambos compuestos en el rango de ph de 3.5 a 7, lo que sugiere mecanismos de solubilización más costosos energéticamente que los necesarios para solubilizar fosfato de calcio, el cual tiene su mayor punto de solubilidad en el rango de ph de 4.5 a 6.5 (Bashan, Kamnev, & de-bashan, 2013). También se ha sugerido que la

60 40 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño toxicidad del aluminio (Al +3 ) que es liberado tras la solubilización, restringe dicha actividad en los microorganismos (Illmer, Barbato, & Schinner, 1995). Con respecto a las correlaciones realizadas, se encontró que la capacidad solubilizadora de fosfato de hierro correlaciona positivamente con la capacidad solubilizadora de fosfato de aluminio, resultado que se esperaba puesto que ambos son los compuestos que se forman en suelos ácidos (Khan et al., 2009) y tienen, como se nombró anteriormente, rangos similares de baja solubilidad que indican que el principal mecanismo de solubilización de ambos compuestos es la producción de agentes quelantes (Bashan et al., 2013), por lo que aislamientos BAFE con ese mecanismo podrían ser los que se destacaron en ambas actividades de solubilización, sin embargo estudios específicos sobre sus mecanismos de acción son necesarios para comprobar dicha posibilidad. Adicionalmente, no se observó una tendencia clara dada por el nivel de fertilidad de los suelos de origen de los aislamientos, es decir que las cepas provenientes de suelos con ph por debajo de 5.5, donde se acompleja el fósforo con hierro y aluminio, se destacaran por encima de las demás. La correlación positiva entre la capacidad de solubilizar fosfato de calcio y aluminio, no se esperaba, dadas las diferencias en la solubilización de ambos compuestos. La solubilización del fosfato de calcio se asocia principalmente a la reducción del ph, ya sea por la producción de ácidos orgánicos de fácil disociación o por la liberación de protones H + asociada a la asimilación de NH 4 + (Bashan et al., 2013; S. B. Sharma et al., 2013), mecanismo que no se relaciona directamente con la solubilización de fosfato de aluminio, por lo que puede sugerirse que las BAFE con alta actividad en ambas fuentes de fosfatos tienen varios mecanismos que le permiten aprovecharlas, este amplio espectro de acción las hace interesantes en el diseño de bioinsumos capaces de movilizar fósforo en suelos ácidos y básicos. De forma descriptiva tampoco se observó que las cepas provenientes de los suelos con niveles de fertilidad alto, suelos que tienen ph por encima de 5.5 donde generalmente se forma el fosfato de calcio, sobresalieran en la solubilización del fosfato de calcio. La producción de compuestos indólicos en el grupo de BAFE se presentó en el 100% de los aislamientos, la producción estuvo entre 0.2 y µg/ml, resultados similares a otras investigaciones realizadas también en BAFE, como la reportada por Kadyan et al. (2013), quienes encontraron que el 92.3% de los aislamientos produjeron compuestos indólicos en un rango de 2.43 a 136 µg/ml, con la diferencia de que en este trabajo la mayoría de cepas se concentra en producciones superiores a 20 µg/ml y en el presente estudio el mayor porcentaje de aislamientos se concentró en las dos primeras categorías, es decir una producción menor a 10 µg/ml. Beneduzi, Peres, da Costa, Bodanese Zanettini, and Passaglia (2008) y Beneduzi, Peres, Vargas, Bodanese-Zanettini, and Passaglia (2008) trabajaron con bacilos provenientes de cultivos de trigo y arroz, respectivamente, pero en la evaluación de los compuestos indólicos no suplementaron el medio con triptófano, conocido precursor de dichos compuestos (Spaepen et al., 2007), encontrando una menor proporción de aislamientos con la capacidad para sintetizar ácido indol acético, alrededor del 32%, pero con rangos de producción y porcentajes que fueron similares a los encontrados en el presente estudio, particularmente por la mayor cantidad de bacilos concentrados en la categoría de 0.1 a 10 µg/ml, lo que sugiere que los aislamientos BAFE provenientes del Urabá antioqueño no son tan eficientes para la producción de AIA, puesto que tienen

61 Presencia de rasgos bioquímicos y biológicos asociados con actividad promotora de crecimiento vegetal en aislados de BAFE 41 producciones similares a las reportadas en dichos trabajos a pesar de haber sido estimuladas con triptófano. No obstante, la producción elevada de AIA no necesariamente es sinónimo de mayor promoción, se sabe que concentraciones elevadas de la hormona pueden resultar estresantes para la planta e inhibir su crecimiento (Farina et al., 2012; Hansen & Grossmann, 2000; Karcz, Lüthen, & Böttger, 1999). Por tanto, los niveles relativamente bajos de producción encontrados para las BAFE no las descarta como promotoras a través de este mecanismo. El resultado negativo de los aislamientos en la prueba de producción de ACC deaminasa puede asociarse con otros trabajos en los que reportan que la actividad productora de ACC deaminasa no es una característica frecuente en microorganismos BAFE, como sí lo es la producción de compuestos indólicos. Es el caso del trabajo de Ramírez (2010), en el que de las 73 cepas evaluadas 50 produjeron compuesto indólicos y ninguna ACC deaminasa; así mismo P. Kumar, Dubey, and Maheshwari (2012) caracterizaron siete aislamientos rizosféricos de Bacillus sp. de los cuales sólo uno fue positivo para la producción de ACC deaminasa y todos fueron productores de compuestos indólicos. Aunque vale la pena mencionar que otros autores han encontrado mayores proporciones de BAFE productoras de ACC deaminasa como Kadyan et al. (2013), quienes aislaron 52 BAFE de la rizósfera de Phyllanthus amarus, obteniendo que el 92.3% produjo compuestos indólicos y el 21% fue positivo para ACC deaminasa. Por otro lado, Nadeem, Shaharoona, Arshadb, and E. (2012) reportaron que del aislamiento de cepas rizosféricas asociadas a plantas de Persea americana en suelos salinos, 10 de los 20 aislamientos con producción de ACC deaminasa pertenecieron al género Pseudomonas, sugiriendo que esta característica está más asociada a este género, y tan sólo dos al género Bacillus. Rashid, Charles, and Glick (2012) evaluaron cepas endófitas de plantas de Solanum lycopersicum, aislando 174, de las cuales 25 produjeron ACC deaminasa, siendo únicamente 5 de ellas del género Bacillus. Adicionalmente, la mayoría de investigaciones en las que se ha encontrado dicha actividad en BAFE emplean una metodología cuantitativa relativamente sensible, basada en la medición de uno de los productos de la hidrólisis del ACC, el α-cetobutirato (P. Kumar et al., 2012; Nadeem et al., 2012; Rashid et al., 2012; Siddikee, Glick, Chauhan, Yim, & Sa, 2011). Lo cual difiere de la aproximación cualitativa que se hizo en el presente trabajo, indicando que la producción de la enzima podría estar presente en algunos aislamientos pero en bajas concentraciones y por ende a través de la técnica empleada no fue detectada. Con respecto a las pruebas de antagonismo, F. oxysporium en particular mostró resistencia al biocontrol, pocos aislamientos (24 de 148, teniendo en cuenta los limitantes) tuvieron actividad antagónica contra este hongo. Otras investigaciones que encontraron una proporción similar en bacilos fueron la de Ratón et al. (2012) quienes reportaron que de 18 BAFE aisladas solamente 2 fueron positivas contra cepas de este hongo, y la de Shanmugam, Atri, Gupta, Kanoujia, and Naruka (2011), donde sólo 4 de los 20 bacilos fueron antagonistas contra este fitopatógeno.

62 42 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Para R. solani se encontró un número importante de cepas positivas, que en total representaron el 29% (43 de 148) de los aislamientos, y que al sumar las cepas limitantes resultarían en un total del 54%. Proporciones que son mayores a las halladas para la población del género Pseudomonas aislada de suelos con diferentes usos agrícolas, donde el 17.4% de los aislamientos mostraron actividad antagónica contra R. solani AG-3 (Paolina Garbeva, Veen, & Elsas, 2004). Estudios de la comunidad bacteriana reportan también porcentajes más bajos a los hallados en el presente estudio, como lo reportado por Ghyselinck et al. (2013) para cultivos de papa de Perú y Bolivia, en esta investigación de 585 aislamientos bacterianos el 9.9 % (58) tuvieron actividad contra R. solani, siendo el 3.8% (22) del género Bacillus. La caracterización de la comunidad bacteriana de suelos reportados como supresivos para R. solani AG-2, R. solani AG-3 y F. oxysporium obtuvo como resultado que el 50%, el 15% y el 18% respectivamente, de las bacterias aisladas tuvieron actividad in vitro contra los fitopatógenos mencionados (Adesina, Lembke, Costa, Speksnijder, & Smalla, 2007; Postma, Schilder, Bloem, & van Leeuwen-Haagsma, 2008), porcentajes menores o similares a los obtenidos para el grupo de BAFE estudiado, lo que indica que estos suelos del Urabá antioqueño son buena fuente de bacterias con capacidad antifúngica, particularmente de BAFE. Teniendo en cuenta además, que se obtuvieron cepas positivas con áreas de inhibición similares estadísticamente a la cepa control, lo que enfatiza su potencial como biocontroladoras. Con respecto a B. cinerea los porcentajes de cepas antagonistas en cada condición de origen fueron del 15 al 50%, teniendo en total 39 (26.3%) como positivas, y 36 (24.3 %) limitantes, porcentajes similares a los encontrados para R. solani, sin embargo para B. cinerea se observó un mayor número de cepas con el área de inhibición similar estadísticamente al control, lo que acentúa su capacidad como antagonistas. No se encontraron estudios recientes sobre caracterización de poblaciones o comunidades bacterianas antagonistas contra B. cinerea, pero sí se hallaron investigaciones que también reportan el efecto antagónico de cepas del género Bacillus sobre dicho fitopatógeno (Arrebola, Sivakumar, Bacigalupo, & Korsten, 2010; Edwards & Seddon, 2001). El alto porcentaje de cepas positivas observadas, destaca al grupo de BAFE y a los suelos rizosféricos del Urabá antioqueño como objeto de estudio en la búsqueda de más y mejores controladores de este fitopatógeno. Finalmente, se observaron tendencias entre las actividades medidas y las condiciones del hábitat de origen, particularmente para la producción de compuestos indólicos y la capacidad antagónica. En la producción de índoles se observó que las cepas con la producción más alta provienen en su mayoría de la rizósfera de maíz, y el mayor porcentaje de cepas con producción baja se concentra en la rizósfera de iraca. Por su parte, los porcentajes de cepas antagonistas contra los tres hongos fitopatógenos se hacen más altos bajo la condición de Iraca-fertilidad baja, sugiriendo que existen condiciones del hábitat que favorecen la presencia de cepas con ciertas actividades promotoras de crecimiento vegetal, aspecto que será abordado con mayor profundidad en el capítulo 6.

63 5. Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz Las BAFE son reconocidas por su capacidad como rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal en una gran variedad de cultivos como arroz, trigo, tomate, algodón, entre otros (Beneduzi, Peres, da Costa, et al., 2008; Beneduzi, Peres, Vargas, et al., 2008; Hassen & Labuschagne, 2010; Souza et al., 2013), esta condición está asociada a rasgos bioquímicos y biológicos que les permiten actuar como biofertilizantes, fitoestimulantes y como bioplaguicidas (Bhattacharyya & Jha, 2012; J. W. Kloepper, Ryu, & Zhang, 2004; Vessey, 2003). La evaluación in vitro de los principales rasgos relacionados con los mecanismos de acción de las PGPR se realizó en el capítulo anterior. La interacción con la planta también define el potencial de las cepas como PGPR, es claro que para caracterizar la actividad promotora de crecimiento vegetal es necesario evaluar el efecto del microorganismo sobre un modelo vegetal, ya que las pruebas in vitro por sí solas no son garantía de que el microorganismo tenga un efecto benéfico visible y representativo sobre la planta, puesto que puede darse que una cepa se destaque en sus rasgos bioquímicos y biológicos asociados a promoción, pero en la evaluación en planta no muestre ningún resultado (Beneduzi et al., 2013; De Freitas, Banerjee, & Germida, 1997), así como casos contrarios, en el que aislamientos que no resaltaron en la etapa in vitro den resultados significativos de promoción al interactuar con las plantas (Arruda et al., 2013; Farina et al., 2012). El conocimiento de dicha condición, hizo necesaria la evaluación en planta del total de las cepas BAFE, complementando así la caracterización como posibles PGPR. El modelo vegetal escogido fue el maíz ICA V109, una de las variedades comerciales más utilizadas en el país, particularmente en las zonas con climas cálidos y cálidos húmedos (DANE, 2005). Esta variedad de maíz es la misma que fue sembrada en los suelos del Urabá antioqueño para generar el contraste rizosférico (Sección 3.1), por ende, es el mismo genotipo vegetal de la rizósfera de donde provienen aproximadamente la mitad de las BAFE. Condición que contribuye al análisis comparativo de la influencia del hábitat de origen sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal, al permitirnos evaluar si la actividad es mayor cuando la planta de origen y la objeto de estudio coinciden, o si es un factor independiente.

64 44 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño A continuación se presenta la metodología, los resultados y la discusión desarrollada en torno al efecto de la inoculación de las BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz. 5.1 Metodología Los 148 aislamientos de BAFE fueron evaluados como posibles promotores del crecimiento vegetal temprano de plantas de maíz (Z. mays), teniendo como indicadores las medidas de longitud y peso seco de las plantas. La prueba se desarrolló en el invernadero del grupo de Microbiología Agrícola, ubicado en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá Preparación de la suspensión de endosporas Se tomó una colonia de la cepa reactivada en medio TSA, la cual fue suspendida en 1 ml de agua destilada estéril, de esta suspensión se tomaron 100µl que fueron extendidos con un asa de Digralsky por la superficie de un medio sólido de esporulación (Bravo & Cerón, 2004), dejándolos en incubación por 15 días a 30 C. Transcurrido el periodo de incubación la biomasa de la caja de Petri fue removida con 10ml de agua destilada estéril y almacenada en frascos ámbar de vidrio a 4 C. De los frascos ámbar se tomaron 100µl para realizar diluciones seriadas 1:10 hasta 10-9 ; de las últimas cuatro diluciones (10-6 a 10-9 ) se sembraron gotas de 20µl en cajas de Petri con agar nutritivo, con el fin de contabilizar la concentración en Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por ml de la suspensión de esporas del frasco ámbar, realizando cuatro gotas de cada dilución por caja, haciendo dos cajas por cepa (Figura 5-1). La concentración obtenida para todas las cepas estuvo entre 1.00 x 10 8 y 2.62 x UFC ml -1 siendo 10 9 UFC ml -1 el orden de magnitud más frecuente. Partiendo del dato de la concentración de la suspensión del frasco ámbar se preparó a partir del mismo 10 ml de una suspensión a una concentración de 1 x 10 8 de UFC ml -1 en agua destilada estéril. Figura 5-1: Caja de Petri con las cuatro últimas diluciones seriadas 1:10 realizadas por cepa.

65 Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz Germinación de las semillas de maíz La variedad escogida para realizar los ensayos de invernadero fue la ICA V109. Las semillas fueron inicialmente desinfectadas haciendo un primer lavado con agua destilada y jabón líquido de manos, un segundo lavado con alcohol al 70% por 6 minutos con agitación constante, y un tercero con hipoclorito al 1.5% por 15 minutos con agitación constante, realizando entre cada lavado tres enjuagues con agua destilada estéril. Una vez desinfectadas las semillas fueron dispuestas en grupos de 10 en cámaras húmedas (caja de Petri con papel absorbente y 10 ml de ADE) por 2 días a 28 C (Figura 5-2A). El lote de semillas que con el paso del tiempo presentaba un porcentaje de germinación inferior al 75% era renovado, evitando así el posible deterioro de la calidad de las semillas Inoculación de las semillas En frascos de vidrio se colocaron grupos de 5 semillas germinadas, las cuales fueron embebidas en los 10ml de la suspensión de esporas de cada aislamiento descrita en la sección Las semillas se dejaron en la suspensión por 30 minutos con agitación cada 5 minutos Prueba en invernadero Las semillas ya inoculadas fueron sembradas por unidad en bolsas negras de 1 k, las cuales contenían un sustrato conformado por arena y gravilla en proporciones 1:1, al sembrarlas se les agregó 1.5 ml de la suspensión de inóculo (Figura 5-2B y D). Por cada cepa se realizaron 5 réplicas. Se tuvo un tratamiento control en el que las semillas fueron embebidas en agua destilada estéril, siguiendo el mismo procedimiento que para los demás tratamientos. Como control positivo se utilizó la cepa AP188 proporcionada por el Dr. Joseph Kloepper de la Universidad de Auburn, Estados Unidos. La cepa se escogió como posible control positivo por ser una cepa de referencia y por ser fisiológicamente similar a los aislados evaluados, es decir por pertenecer al grupo BAFE. El riego consistió en mantener las bandejas que contenían las bolsas con un nivel de 3 cm de agua, asegurando así condiciones de humedad para el sustrato; la temperatura del invernadero durante la prueba fue de C, y el fotoperiodo de 12:12 horas luz: oscuridad. Cada prueba se desarrolló durante un mes (Figura 5-2E) Longitud y peso seco de las plantas Una vez terminado el periodo de permanencia bajo condiciones de invernadero, las plantas fueron extraídas del sustrato, lavadas y medidas (Figura 5-2C), tomando por separado la longitud del vástago y de la raíz. Cada una de estas dos partes fue

66 46 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño empacada en bolsas de papel para su secado en horno a 65º C por 2 días, tiempo después del cual fueron pesadas. Figura 5-2: Diferentes fases de la prueba de invernadero. A. Cámara húmeda donde las semillas ya desinfectadas se colocaban a germinar. B. Proceso de siembra de las semillas germinadas, se puede observar el sustrato de arena-gravilla 1:1 empleado. C. Plantas extraídas y lavadas luego de un mes de crecimiento en el invernadero. D. Plantas de maíz una semana después de haber sido sembradas. E. Las instalaciones del invernadero con plantas de un mes de crecidas. A. B. C D E Repetición en el tiempo Las cepas que resultaron, según la prueba estadística de Tukey, superiores al control en longitud o peso, fueron evaluadas nuevamente en el invernadero siguiendo los mismos procedimientos ya descritos, lo único que varió fue el periodo de permanencia de las plantas en el invernadero, este no fue de 30 días si no de 25. Las suspensiones de endosporas de las cepas a repetir, almacenadas a 4 C, fueron nuevamente evaluadas por conteo en caja asegurando así su viabilidad y concentración.

67 Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz Análisis estadístico Para determinar las cepas que promovían el crecimiento vegetal de las plantas de maíz, o lo que es lo mismo los tratamientos que estadísticamente eran superiores al tratamiento control, se realizaron pruebas de Análisis de Varianza, confirmando con anterioridad la normalidad de los datos a través de las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk. A los Análisis de Varianza que mostraron diferencia entre las cepas se les realizó las pruebas de comparaciones múltiples LSD para observar tendencias en los resultados, posteriormente a las cepas positivas con la prueba LSD se les aplicó una prueba de comparaciones múltiples más restrictiva, la prueba de Tukey, estableciendo así las cepas que más se destacaron y que se repetirían en el tiempo. Adicionalmente se evaluó la correlación entre los rasgos bioquímicos de las cepas que promovieron y cada una de las variables asociadas a promoción de crecimiento en planta a través del estadístico no paramétrico de Spearman (ρ). La relación con los rasgos biológicos se analizó a través de la prueba estadística de independencia basada en el estadístico chi-cuadrado (X 2 ). Todas las pruebas estadísticas utilizadas se analizaron con un nivel de significancia del Los análisis estadísticos se desarrollaron con el programa RGui (R Core Team, 2012). 5.2 Resultados De los 148 aislamientos evaluados 79 mostraron promoción en una o más de las variables medidas (Anexo C). 68 cepas fueron superiores al control en longitud de tallo, de las cuales 24 pertenecen a la rizósfera de iraca, 16 (24%) del suelo de alta fertilidad y 8 (12%) del de baja, y 44 a la rizósfera de maíz, 26 (38%) del suelo de alta fertilidad y 18 (26%) del de baja (Figura 5-3A). La longitud de raíz fue promovida por 25 aislamientos, 9 provenientes de iraca, 5 (20%) del suelo de alta fertilidad y 4 (16%) del de baja, y 16 de la rizósfera de maíz, 10 (40%) de los suelos con alta fertilidad y 6 (24%) de los de baja (Figura 5-3C). Con respecto a la promoción de biomasa en el vástago, 29 cepas fueron superiores al control, 14 pertenecen a la rizósfera de iraca, 6 (21%) del suelos de alta fertilidad y 8 (28%) del de baja, y 15 a la rizósfera de maíz, 5 (17%) de los suelos con alta fertilidad y 10 (34%) de los de baja (Figura 5-3B). La promoción de biomasa en la raíz se observó en 8 cepas, 4 de la rizósfera de iraca, 3 (37%) de suelos con alta y 1 (13%) de suelos con baja, y 4 de la rizósfera de maíz, 2 (25%) de suelos con alta fertilidad y 2 (25%) de baja (Figura 5-3D). Dentro del análisis estadístico se hallaron cepas que fueron estadísticamente inferiores al control, lo que podría señalar una inhibición al crecimiento temprano de las plantas de maíz. En la longitud del vástago la cepa IA1C10, en la longitud de raíz la cepa MM4C10, en el peso seco del vástago IA1C10, IM3C4, IM4C6, IT1C4 y en el peso seco de la raíz

68 48 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño MM2C13 y MT2C6, los rasgos bioquímicos de estas cepas en particular se muestran en la Tabla 5-1. Figura 5-3: Porcentaje de las cepas que promovieron el crecimiento vegetal temprano de las plantas de maíz, medido a través de la longitud (A.) y el peso seco del vástago (B.), así como la longitud (C.) y el peso seco de la raíz (D.). Las cepas se clasificaron según sus características de planta y suelo de origen Ifa (Iraca-Fertilidad alta), Ifb (Iraca- Fertilidad baja), Mfa (Maíz-Fertilidad alta), Mfb (Maíz-Fertilidad baja). A. B. C. D Repetición en el tiempo De las 79 cepas que presentaron promoción de crecimiento, 11 aislamientos fueron los que estadísticamente más se destacaron por encima del control, de acuerdo a la prueba de Tukey que es más restrictiva que la de LSD. La cepa AP188 fue superior al control con la prueba LSD, pero no se destacó con la prueba de Tukey, por lo que se descartó como control positivo.

69 Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz 49 La longitud del vástago fue la variable en la que más cepas (7) mostraron resultados significativamente mayores, seguida por el peso seco del vástago (4), el peso seco de la raíz (2) y la longitud de la raíz (1). Los aislamientos IA3C8, MT1C8 y MGC9 presentaron promoción en dos de las cuatro variables medidas (Tabla 5-2). De los 7 aislamientos que promovieron la longitud del vástago, 6 provienen de la rizósfera de maíz, 4 de los cuales provienen de suelos con alta fertilidad y 2 de los de baja; el aislamiento restante es de la rizósfera de iraca proveniente de un suelo de alta fertilidad. Con respecto a la promoción en la longitud de la raíz, sólo un aislamiento resultó positivo, este proviene de la rizósfera de iraca con suelo de baja fertilidad. Con respecto a la biomasa (peso seco) del vástago, de los 4 aislamientos positivos en promoción, 2 son de la rizósfera de iraca, ambos de suelos con alta fertilidad, y los 2 restantes son de la rizósfera de maíz, perteneciendo cada uno a una zona diferente en términos de fertilidad del suelo, estos dos últimos aislamientos provienen de un origen similar a los aislamientos que promovieron la producción de biomasa en raíz. Los rasgos bioquímicos y biológicos asociados a promoción de crecimiento hallados para las 11 cepas que fueron escogidas para la repetición en el tiempo se presentan en la Tabla 5-3. Tabla 5-1: Rasgos bioquímicos y biológicos de las cepas que fueron inferiores estadísticamente al control. Cepa SFC (mg/l) SFH (mg/l) SFA (mg/l) PI (ug/ml) Antagonismo Rs Bc Fo IA1C P P P MM4C N N N IM3C N N N IM4C P P P IT1C L P N MM2C N N N MT2C N N N Solubilización de fosfato de calcio (SFC), Solubilización de fosfato de hierro (SFH), Solubilización de fosfato de Aluminio (SFA), Producción de compuestos indólicos (PI.), Antagonismo contra Rhizoctonia solani (Rs), Botrytis cinerea (Bc) y Fusarium oxysporum (Fo.).

70 50 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Tabla 5-2: Promoción de crecimiento de las cepas que se destacaron estadísticamente según la prueba de Tukey. Cada cepa presenta el promedio y la desviación estándar de la variable donde promovió. Cepa Control negativo Longitud de vástago (cm.) Longitud de raíz (cm.) Peso seco de vástago (g) Peso seco de raíz (g) 33.1 ( ) 48.5 ( ) ( ) ( ) IA3C ( ) ( ) IA1C ( ) IGC ( ) MA1C ( ) MA1C ( ) MA1C ( ) MT1C ( ) ( ) MA3C ( ) MGC ( ) ( ) MM4C ( ) MM4C ( ) En la repetición en el tiempo, 2 de las 11 cepas estuvieron nuevamente por encima del control. La cepa MA3C5 en la primera prueba de invernadero promovió la producción de biomasa de raíz en un 56.7% (Tabla 5-2), en la repetición en el tiempo la cepa promovió no solo la biomasa de la raíz (76%), sino también la longitud (34%) y la biomasa del vástago (95.3%) (Tabla 5-4) La cepa MT1C8 en la primera prueba promovió la longitud y la producción de biomasa del vástago en un 44.4% y en un 95.5%, respectivamente (Tabla 5-2), en la repetición promovió nuevamente la longitud del vástago (24.9%), y adicionalmente la biomasa en raíz (83.1%) (Tabla 5-4). Ninguna de las cepas promovió la longitud de la raíz. En la anterior prueba sólo la cepa IGC4 se había destacado por esto, no obstante en la repetición en el tiempo no fue estadísticamente superior al control (Tabla 5-4).

71 Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz 51 Tabla 5-3: Rasgos bioquímicos y biológicos de las cepas que fueron escogidas para la repetición en el tiempo. Cepa SFC (mg/l) SFH (mg/l) SFA (mg/l) PI (ug/ml) Antagonismo Rs Bc Fo IA3C N L N IA1C L L N IGC P P N MA1C N N N MA1C N N N MA1C L L N MT1C N N N MA3C N N N MGC N N N MM4C L L N MM4C P P P Solubilización de fosfato de calcio (SFC), Solubilización de fosfato de hierro (SFH), Producción de compuestos indólicos (PI.), Antagonismo contra Rhizoctonia solani (Rs), Botrytis cinerea (Bc) y Fusarium oxysporum (Fo.) Relación entre la promoción de crecimiento en planta y los rasgos bioquímicos y biológicos La relación entre los rasgos bioquímicos, obtenidos en el capítulo 4, y la variable de promoción de crecimiento para las cepas que resultaron positivas en cada una de ellas fueron significativas sólo para la longitud y la producción de biomasa del vástago. Tanto la longitud como la producción de biomasa del vástago se relacionaron positivamente con la solubilización de fosfato de aluminio y la producción de compuestos indólicos. Los demás rasgos no tuvieron relaciones significativas con las variables asociadas a vástago. Las variables asociadas a la raíz no mostraron relación con ninguno de los rasgos bioquímicos de las cepas que promovieron su longitud y peso seco (Tabla 5-5).

72 52 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Tabla 5-4: Promoción de crecimiento de las cepas que se repitieron en el tiempo. Los asteriscos (*) señalan las medidas estadísticamente superiores al control con p-valor < Cepa Longitud de vástago (cm.) Longitud de raíz (cm.) Peso seco de vástago (g) Peso seco de raíz (g) Control negativo 31.9 ( ) 44.9 ( ) 0.161( ) ( ) IA3C ( ) 57.2 ( ) ( ) ( ) IA1C9 IGC4 MA1C11 MA1C9 MA1C16 MT1C8 MA3C5 MGC9 MM4C1 MM4C ( ) 48.2 ( ) ( ) ( ) 35.4 ( ) 48.6 ( ) ( ) ( ) 36.1 ( ) 51.3 ( ) ( ) ( ) 33.1 ( ) 48.5 ( ) ( ) ( ) 36.4 ( ) 49.4 ( ) ( ) ( ) 39.8 ( )* 51.8 ( ) ( ) ( )* 42.7 ( )* 56.8 ( ) ( ) * 0.33 ( )* 36.3 ( ) 50.8 ( ) ( ) ( ) 38.0 ( ) 50.7 ( ) ( ) ( ) 35.4 ( ) 46.1 ( ) ( ) ( ) Tabla 5-5: Estadístico y p-valor en paréntesis de la prueba no paramétrica de correlación de Spearman (ρ) entre los rasgos bioquímicos y las variables asociadas a promoción de crecimiento en planta. Los asteriscos (*) señalan las correlaciones estadísticamente significativas con p-valor < Variable de la planta asociada a promoción de crecimiento SFC SFH SFA PI Longitud del vástago (0.958) (0.098) (0.049)* (0.016)* Longitud de la raíz (0.728) (0.739) (0.369) (0.548) Peso seco del vástago (0.294) (0.133) (0.050)* (0.032)* Peso seco de la raíz (0.191) (0.785) (0.204) (0.348) Solubilización de fosfato de calcio (SFC), Solubilización de fosfato de hierro (SFH), Producción de compuestos indólicos (PI.).

73 Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz 53 Con respecto a la actividad antagónica se relacionó la cantidad de cepas que promueven y no promueven crecimiento en planta con su actividad antagónica. La actividad fue definida en tres categorías: 1. Las cepas que fueron positivas contra dos o los tres hongos; 2. Las cepas que fueron limitantes contra dos o los tres hongos; 3. Las cepas que fueron negativas para dos o los tres hongos. Se encontró que de las 79 cepas que presentaron promoción en una o dos variables, 15 (19%) fueron de la categoría 1, 23 (29%) de la 2 y 41 (52%) aislamientos de la categoría 3. De las 69 cepas que no presentaron promoción, 22 (32%) pertenecieron a la categoría 1, 16 (23%) a la 2 y 31 (45%) a la 3 (Figura 5-4). La asociación entre la capacidad de promover crecimiento vegetal y la categoría de antagonismo no fue observada (X 2 = 3.31; p-valor= 0.191). Figura 5-4: Porcentaje de cepas que pertenecen a cada una de las categorías de actividad antagónica contra los tres hongos fitopatógenos. Cepas que presentaron promoción de una o dos variables asociadas a promoción de crecimiento en planta (A.) y cepas que no presentaron promoción de ninguna variables asociada a promoción de crecimiento en planta (B.). A. B. Categorías: 1. Cepas que fueron positivas contra dos o los tres hongos fitopatógenos; 2. Las cepas que fueron limitantes contra dos o los tres hongos fitopatógenos; 3. Las cepas que fueron negativas para dos o los tres hongos fitopatógenos. 5.3 Discusión El 53.4% (79) de las BAFE evaluadas mostraron promoción de crecimiento estadísticamente significativo, en una o dos de las variables medidas. El porcentaje de cepas que se destacaron en la prueba es un resultado que es difícil de comparar con otras investigaciones, puesto que la mayoría de los estudios que caracterizan microorganismos PGPR, tienen un diseño en el que la interacción con la planta en invernadero o en campo, no es un complemento a la caracterización, si no la prueba última para confirmar su potencial, evaluación a la que llegan sólo algunas cepas seleccionadas por sus rasgos bioquímicos y biológicos. Un diseño que puede dejar por

74 54 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño fuera cepas que tienen la capacidad de promover, pero que a nivel in vitro no se destacaron, o que tienen un rasgo efectivo pero diferente a los que fueron evaluados. Investigaciones con las que se podría comparar el porcentaje obtenido, son aquellas en las que pruebas de germinación y crecimiento temprano de plantas fueron empleadas para seleccionar el grupo de cepas con el que continuarían la caracterización, es decir investigaciones que al igual que el presente estudio, evaluaron en invernadero todas las cepas que hallaron. Tal es el caso del trabajo realizado por Mehnaz, Kowalik, Reynolds, and Lazarovits (2010), en el que de 45 morfotipos aislados en total, 4 mostraron promoción en dos variedades de maíz; la investigación de Piromyou et al. (2011), en la que basados en la promoción en la germinación de semillas de maíz, de 153 aislamientos escogieron los 10 más destacados para continuar con el estudio; y el trabajo de Hassen and Labuschagne (2010), en el que de 86 aislamientos 4 fueron positivos en la promoción de trigo, tomate o sorgo, siendo las 4 cepas del grupo BAFE. Con base en esos estudios se puede considerar que la cantidad de cepas BAFE del Urabá antioqueño que mostraron promoción fue alto, y no sólo la cantidad, también los porcentajes de promoción encontrados en cada variable, puesto que el mayor porcentaje de promoción obtenido en la longitud del vástago fue del 62% con la cepa IA3C8 y del 45% en la longitud de la raíz con la cepa IGC4, el porcentaje más alto en la promoción de crecimiento del vástago fue del 138% y de la raíz del 66%, resultado obtenido para las cepas MGC9 y MM4C6 respectivamente. Las proporciones son elevadas al compararlas con lo reportado por Egamberdiyeva (2007), quien obtuvo para plantas de maíz que una cepa de Bacillus polymyxa promovió en cuatro semanas el peso seco del vástago, en un 26%, y el de la raíz, en un 30%; y con lo reportado por Piromyou et al. (2011), los cuales obtuvieron incrementos del 45% aproximadamente en el peso seco de dos variedades de maíz luego de la inoculación con una cepa de Brevibacillus sp. durante cinco semanas. Al clasificar los 79 aislamientos por la variable que promovieron y por su característica de hábitat de origen, se observó que para la longitud de vástago y raíz la mayoría de las cepas provienen de la rizósfera de maíz, principalmente de la combinación maíz-fertilidad alta, lo que podría asociarse al hecho de que la planta y la variedad utilizada en el contraste rizosférico en campo y en la prueba de invernadero son la misma, y por ende los aislamientos están adaptados a las condiciones que ofrece la rizósfera, lo que podría darles ventajas en la interacción con la planta y en el uso eficiente de los exudados de la raíz (Ahmad, Husain, & Ahmad, 2011), tal como lo obtenido por Bhattarai and Hess (1993), quienes encontraron que la cepa del género Azospirillum más efectiva en la promoción de trigo de una variedad específica fue aquella que provenía de esta misma variedad. Correlaciones entre algunos de los rasgos bioquímicos de las 79 cepas y la variable donde se obtuvo promoción de crecimiento, mostraron significancia estadística, particularmente con las variables relacionadas con el crecimiento del vástago. En este sentido, la promoción en la longitud y peso seco del vástago se relacionaron de forma positiva con la solubilización de fosfato de aluminio y con la producción de compuestos indólicos. Merece mencionar que dadas las características del ensayo, la correlación entre producción de compuestos indólicos y la promoción de crecimiento presenta mucho sentido dado que el sustrato empleado en el bioensayo de promoción de crecimiento es inerte, por lo que se espera que el aporte en las características de promoción de los

75 Efecto de la inoculación de los aislados de BAFE sobre el crecimiento temprano de plantas de maíz 55 aislamientos estén más asociadas a la producción de sustancias reguladoras de crecimiento vegetal. Aunque, no se puede descartar la presencia de algún tipo de complejos fosforados asociados al sustrato, que haya estimulado la expresión de mecanismos de solubilización de fosfato que expliquen la correlación presentada entre promoción y solubilización de fosfato de aluminio. Sin embargo, estudios más controlados deben ser llevados a cabo para poder verificar dicha hipótesis. De las cepas que promovieron crecimiento, aquellas con producciones de compuestos indólicos por encima de 10 µg/ml, en su mayoría promovieron la longitud del vástago, observación que explica la correlación positiva y que podría asociarse a la sensibilidad diferencial del AIA en los órganos de las plantas, se sabe que la raíz es más sensible que el tallo, es decir que a concentraciones donde el crecimiento de la raíz se inhibe se estimula el del tallo (Acosta Echeverría, Sanchez Bravo, & Bañón Arnao, 2000). Resultados similares han sido reportados por Marques, Pires, Moreira, Rangel, and Castro (2010) y por Beneduzi, Peres, da Costa, et al. (2008) para poblaciones de BAFE. Entre la promoción de crecimiento vegetal obtenida in vivo y la actividad antagonista no se observó ningún tipo de relación en las BAFE, sugiriendo que los mecanismos de fitoestimulación, biofertilización y biocontrol no están relacionados entre sí en este grupo. Algunas cepas como la IA1C8, IGC1, IGC3, MA3C9 y la MM4C6 se destacaron por promover alguna de las variables asociadas a la promoción de crecimiento y por ser antagónicas contra los tres fitopatógenos, lo que las hace relevantes para futuras investigaciones. En los resultados se obtuvieron 7 cepas que fueron estadísticamente inferiores al control, es decir que inhibieron el crecimiento. Al revisar sus rasgos bioquímicos y biológicos, no se encontraron tendencias que pudieran asociarse al efecto inhibidor, así que podría ser efecto de un factor común no evaluado o uno en particular de cada cepa. Por ejemplo, la cepa IM3C4 presentó un peso seco del vástago inferior al del control, siendo una de las cepas con mayor producción de compuestos indólicos, las cepas que promovieron la longitud y el peso seco del vástago tuvieron una producción máxima de 33 µg/ml, por lo que los 45.7 µg/ml de la cepa IM3C4 pueden ser ya inhibitorios para la planta. De las 11 cepas escogidas para la repetición en el tiempo, la mayoría (8) son de la rizósfera de maíz, es decir que además de ser la rizósfera de origen con la mayor cantidad de aislamientos promotores de la longitud de raíz y vástago, resultado obtenido con la prueba LSD, los aislamientos provenientes de maíz también fueron de los que más se destacaron por su capacidad de promoción según la prueba de comparación por pares de Tukey, lo que parece obedecer a la relación entre la planta de origen y la utilizada en la prueba, tal como se describe anteriormente, puesto que al revisar los rasgos bioquímicos y biológicos de las 11 cepas, evaluados en el capítulo anterior, no se encontró un patrón, es decir que los aislamientos con mayor promoción no coinciden con los de mayor capacidad solubilizadora de alguna fuente de fosfato, o los de mejor producción de indoles, lo cual podría indicar también que existen otros rasgos no evaluados que generaron su actividad promotora, como por ejemplo la producción de giberelina, fitohormona que se ha encontrado en representantes del grupo BAFE como Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis (Gutiérrez Mañero et al., 2001), Bacillus cereus y Bacillus macroides (Joo, Kim, Lee, Song, & Rhee, 2004), y que puede producir también

76 56 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño en la planta la elongación del tallo al estimular la división y crecimiento de las células (Bottini, Cassán, & Piccoli, 2004; Joo et al., 2004) Las cepas provenientes de iraca que pertenecen al grupo de las 79 cepas promotoras, y particularmente las 3 cepas que hicieron parte de las 11 más destacadas en promoción, son aislamientos que generan interés por su posible efecto de amplio espectro, puesto que son cepas que a pesar de su origen logran mostrar su actividad en la rizósfera de maíz, característica que es llamativa en el sentido de poder generar bioinsumos que no sean planta o variedad específicos, si no que por el contrario, tengan un uso más generalizado. En la repetición en el tiempo dos aislamientos fueron consistentes con los resultados iniciales, mostrando promoción en otras variables adicionales a las que se obtuvieron inicialmente. La cepa MA3C5 inicialmente promovió la producción de biomasa en la raíz y en la repetición mostró promoción adicionalmente en la longitud y el peso seco del vástago. La cepa MT1C8 promovió la longitud del vástago, en ambas repeticiones, y la producción de biomasa tanto en raíz como en vástago. Es decir que ambas cepas promovieron tres de las cuatro variables medidas y en unos porcentajes altos. La capacidad de estos aislamientos no coincide con niveles destacados o diferenciales en alguno de los rasgos asociados a la promoción de crecimiento vegetal aquí analizados, por lo que se hace relevante realizar estudios posteriores que permitan evaluar más mecanismos de acción o de interacción con la planta, para poder profundizar en el conocimiento de estas dos cepas promisorias. El hecho de haber tenido consistencia en dos de los once aislamientos que fueron seleccionados para la repetición en el tiempo, puede indicar que se tuvo alguna variación en los ensayos que motivó la diferencia en los resultados. Ambos ensayos se hicieron en el mismo invernadero, con el mismo sustrato y la misma variedad de maíz, la variabilidad intrínseca a las semillas se ve reflejada en la variabilidad dentro de cada tratamiento. El manejo de controles negativos en ambos ensayos fue clave para descartar diferencias dadas por condiciones medio ambientales, ya que los resultados de los controles en los ensayos fueron estadísticamente iguales. La diferencia principal que se dio entre la primera prueba y su repetición en el tiempo fue la necesidad de retirar 5 días antes las plantas, es decir que los tratamientos duraron 25 días y no los 30 días del primer ensayo, esta diferencia pudo haber repercutido en la actividad de las nueve cepas que no mostraron promoción en la repetición. En ese contexto, Piromyou et al. (2011) en su investigación, muestran la homogeneidad de las plantas de maíz inoculadas con cepas potencialmente promotoras durante las dos primeras semanas, a diferencia de la semana quinta, donde en algunos tratamientos observaron el efecto del inóculo en el crecimiento vegetal. No obstante, la confirmación del efecto del tiempo sobre la actividad promotora de las nueve cepas BAFE requiere de estudios enfocados a tal fin.

77 6. Relaciones entre el hábitat de origen de los aislados de BAFE y su capacidad promotora de crecimiento vegetal La rizósfera es un hábitat particular, diferente al suelo que no tiene interacción con las raíces de la planta. El aporte de la planta a través de los exudados radiculares, permite que dicho hábitat tenga una mayor concentración de fuentes de carbono para los microorganismos, al tiempo que ejerce cambios en el ph, en el potencial redox y en la disponibilidad de elementos esenciales o nutrientes, como el Fósforo y el Hierro (Hinsinger, Gobran, Gregory, & Wenzel, 2005). El suelo por su parte, es la matriz que contiene a la rizósfera, es por ello que algunos investigadores han concluido que de sus características físico-químicas y de la comunidad microbiana preexistente va a depender la selección que la planta pueda hacer a través de sus exudados (Chiarini, Bevivino, Dalmastri, Nacamulli, & Tabacchioni, 1998; Hartmann, Schmid, Van Tuinen, & Berg, 2009), por lo que haría parte integral en la definición de la comunidad microbiana rizosférica. Sin embargo, al estudiar diferentes poblaciones de microorganimos rizosféricos, la mayor influencia de uno u otro factor no es del todo clara, tal como se expone en el capítulo 1 se han reportado varias investigaciones en las que poblaciones y comunidades rizosféricas pueden verse afectadas en sus propiedades estructurales principalmente por uno de los dos, o por la interacción de ambos factores. Con respecto a las propiedades funcionales de las comunidades y poblaciones rizosféricas, son pocos los trabajos que abordan la posible influencia de los factores que definen el hábitat de la rizósfera (planta y suelo) sobre grupos funcionales, particularmente sobre aquellos relacionados con la actividad promotora de crecimiento vegetal. La interacción simbiótica entre las plantas y las PGPR hace suponer que la planta puede ser el factor principal de selección, al atraer y estimular la colonización de microorganismos benéficos para su crecimiento (Hartmann et al., 2009), no obstante el suelo, como se dijo anteriormente hace parte integral del hábitat, por lo que no se puede descartar su influencia en las propiedades funcionales de la comunidad. Adicionalmente, cada planta y tipo de suelo generan una rizósfera particular, lo que sugiere que una planta, un tipo de suelo, o una interacción específica de estos dos factores podría generar la selección de un grupo funcional en particular.

78 58 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Con el fin de entender mejor la posible relación entre el hábitat de las BAFE y su actividad promotora de crecimiento vegetal, en este capítulo se reunieron los resultados obtenidos en la evaluación de los rasgos bioquímicos y biológicos, así como lo obtenido en la interacción con la planta de maíz bajo condiciones de invernadero, es decir, se tomó en conjunto la caracterización realizada a las 148 cepas y desde la estadística se buscó la influencia que la rizósfera de origen de las cepas podría tener sobre su desempeño como PGPR. Con el desarrollo de este capítulo se pudo contestar y culminar el objetivo general que se planteaba esta investigación, dejando por supuesto, nuevas preguntas y temas por profundizar. A continuación se describe la metodología, los resultados y la discusión obtenidos para este último objetivo específico. 6.1 Metodología y resultados Relación de los rasgos bioquímicos y biológicos analizados in vitro con el hábitat de origen de las BAFE Para establecer posibles relaciones estadísticamente significativas entre los rasgos bioquímicos y biológicos asociados a promoción de crecimiento vegetal y las características del lugar de origen de las cepas (planta y nivel de fertilidad del suelo), se realizó la prueba estadística de independencia basada en el estadístico chi-cuadrado (X 2 ), con un nivel de significancia de 0.05 (Tabla 6-1). Los datos empleados en las pruebas fueron las frecuencias obtenidas en cada uno de los niveles de solubilización de fosfatos, producción de compuestos indólicos y actividad antagónica descritos en el Capítulo 4, esto relacionado precisamente con la planta y el nivel de fertilidad del suelo. Como se puede observar en la Tabla 6-1 ninguna de las pruebas asociadas a la solubilización de fosfato mostró dependencia en relación con el hábitat de origen de los aislamientos, sugiriendo que el aislamiento de cepas de BAFE con capacidad para solubilizar cualquiera de las fuentes de fosfato inorgánico evaluadas no está determinado ni por la planta ni por el tipo de fertilidad bajo estudio. Por otra parte las pruebas estadísticas implementadas mostraron que el nivel de producción de compuestos indólicos de las cepas evaluadas, depende de las condiciones de origen de las mismas, particularmente del tipo de planta de donde fueron obtenidas, puesto que la rizósfera de maíz fue la condición que mostró una mayor cantidad de cepas con el mayor nivel de producción de compuestos indólicos (mayor a 10 µg/ml), contrario a iraca que presentó la frecuencia más alta en el nivel inferior de producción (0.2 a 4 µg/ml), tendencia que se observa clara en la Figura 4-8 y que se confirma a través de la estadística. De forma similar la actividad antagónica contra los tres hongos fitopatógenos mostró dependencia entre la cantidad de cepas con resultado positivo y las condiciones del hábitat de origen de las cepas. Es de resaltar que la mayor cantidad de aislamientos con actividad antagónica se presentaron bajo la combinación de origen iraca-baja fertilidad,

79 Relaciones entre las características del origen de los aislados de BAFE y su capacidad promotora de crecimiento vegetal 59 esto para los tres hongos fitopatógenos (Figura 4-9, Figura 4-11 y Figura 4-13). Adicional a la alta frecuencia de aislados positivos, la combinación iraca-fertilidad baja es el hábitat de origen de 11 (58%) de las 18 cepas que presentaron actividad antagónica contra los tres hongos (Figura 6-1), es decir que esta condición favoreció la presencia de un gran número de cepas antagónicas y de aquellas con un espectro amplio de actividad. Tabla 6-1: Resultado de la prueba de independencia entre los rasgos bioquímicos y biológicos y el hábitat de origen de los aislados. Rasgo bioquímico o biológico Estadístico (X 2 ) (p-valor) Independencia con el hábitat de origen Solubilización de Fosfato de calcio 5.12 (0.528) Sí Solubilización de Fosfato de hierro 7.81 (0.252) Sí Solubilización de Fosfato de aluminio Producción de compuestos indólicos 5.50 (0.481) Sí (0.002) No Antagonismo contra R. solani (0.016) No Antagonismo contra B. cinerea (0.016) No Antagonismo contra F. oxysporum (0.001) No Relación entre la promoción de crecimiento en planta y el hábitat de origen de las BAFE Para establecer relaciones entre la cantidad de cepas que promovieron el crecimiento de la planta en cada una de las variables asociadas a este fenómeno y las características del hábitat de origen de las cepas (planta y nivel de fertilidad del suelo), se realizó la prueba estadística de independencia basada en el estadístico chi-cuadrado (X 2 ). Adicionalmente se realizó un análisis por componentes principales, evaluando previamente la correlación entre variables a través del estadístico de Pearson. Todas las pruebas estadísticas se llevaron a cabo con el programa RGui (R Core Team, 2012), con un nivel de significancia de 0.05.

80 60 Efecto de la selección rizosférica sobre la actividad promotora de crecimiento vegetal de bacterias aeróbicas formadoras de endospora provenientes del Urabá antioqueño Figura 6-1: Porcentaje de las cepas que presentaron actividad antagónica contra los tres hongos fitopatógenos. Las cepas se clasificaron según sus características de planta y suelo de origen Ifa (Iraca-Fertilidad alta), Ifb (Iraca-Fertilidad baja), Mfa (Maíz-Fertilidad alta), Mfb (Maíz-Fertilidad baja). Tabla 6-2: Resultado de la prueba de independencia entre las variables de la planta asociadas a promoción de crecimiento y el hábitat de origen de los aislados. Variable de la planta asociada a promoción de crecimiento Estadístico (X 2 ) (p-valor) Independencia con el hábitat de origen Longitud del vástago (0.0003) No Longitud de la raíz 5.29 (0.151) Sí Peso seco del vástago 4.67 (0.197) Sí Peso seco de la raíz 0.45 (0.928) Sí Como se puede observar en la Tabla 6-2, se encontró que la longitud del vástago es la única variable que es dependiente de las características del hábitat, siendo la combinación maíz-fertilidad alta, la condición con mayor cantidad de cepas promotoras de ésta variable. Con respecto a las demás variables se encontró independencia entre las condiciones de origen y la cantidad de cepas que promovieron y no promovieron.